淋巴组织增生性疾病患者外周血EBV DNA定量检测临床意义的研究进展

王 媛,李文生(.西安医学院，西安 70068；.陕西省人民医院病理科，西安 70068)

爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)，也称为人类疱疹病毒4型(HHV-4)，是一种双链DNA 病毒，长度约172 KB[1]。据估计，超过90%的世界人口感染过EBV，进入人体的绝大多数EBV 被免疫系统所清除，仅有少数EBV 潜伏在人体的B细胞中，并终身携带。EBV感染可对机体免疫系统造成持续慢性刺激,引起B细胞的多克隆激活。1964年Epstein 首先从非洲儿童Burkitt 淋巴组织中分离出EBV，随后研究发现EBV 存在于超过95%的地方性Burkitt 淋巴瘤和大约20%的非地方性Burkitt淋巴瘤。此外EBV是传染性单核细胞增多症的病原体，并与鼻咽癌、儿童淋巴瘤的发生有密切相关性，被列为可能致癌的人类肿瘤病毒之一。近年来研究发现除了传染性单核细胞增多症（infectious mononucleosis,IM）和伯基特淋巴瘤以外，在越来越多的淋巴组织疾病中检测到EBV感染，包括EBV 阳性淋巴组织增殖性疾病（EBV+LPD），NK/T细胞淋巴瘤，经典霍奇金淋巴瘤、血管免疫母细胞淋巴瘤、EBV(+)弥漫大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿等，虽然EBV感染在这些淋巴组织疾病发生中的作用和机制还不甚清楚，但说明EBV感染与淋巴组织疾病的关系越来越密切。

以往研究认为EBV（+）LPD 及传染性单核细胞增多症患者的外周血EBV DNA 有高拷贝数，而EBV 相关淋巴瘤的外周血EBV DNA 拷贝数一般不高。近几年有不少文献报道EBV 相关淋巴瘤外周血EBV DNA 也出现高拷贝数，这为此类疾病的鉴别诊断带来了困惑。甚至还有一些研究显示EBV DNA 载量的检测不仅可以用于EBV 相关淋巴组织增生性疾病的诊断，还可用于评价患者对治疗的反应及预后。本文对EBV感染的实验室检测方法和各种淋巴组织增生性疾病患者外周血EBV DNA定量检测的相关文献进行综述，并分析其在治疗反应、预后判断中的价值和意义。

1 EBV感染的检测方法

1.1组织中EBER 原位杂交检测 EBER（EBVencoded RNA）是EBV 编码的小RNA,在EBV感染的细胞核中以高拷贝数存在，EBER 原位杂交法因其准确的定位、极高的特异度和灵敏度已成为组织切片中检测EBV的首选方法。其具体过程包括切片与脱蜡、预处理、变性、杂交、免疫显色、切片复染。EBER 原位杂交检测方法主要优点在于原位，可以对靶序列进行组织、细胞的空间定位，敏感性高、特异度强、定位清晰，是目前公认检测EBV的金标准[2]。但其属于侵入性检测，需取组织病理活检，有时因为病人一般状况差或其它原因可能难以取到活检组织标本，同时影响染色结果的因素比较多,操作过程较为繁琐。

1.2 血清EBV 抗体检测 EBV 抗体检测是检测EBV的另一种方法。EBV 具有多种抗原，包括衣壳抗原（VCA）、早期抗原（EA）、膜抗原（MA）、核心抗原（EBNA）等，感染后产生相应的抗体。临床上EBV 抗体检测以VCA-IgM，VCA-IgG，VCA-IgA为主，其中，最早出现的是VCA-IgM，2周左右即可到达峰值，具有较强的敏感度及特异度，其可以反映新近感染情况，VCA-IgM 抗体持续时间大约是4～8 周，最长约2～3个月。一般情况下，VCA-IgG 较VCA-IgM 晚出现，大约3～5 周内达到峰值，然后略微降低并长时间持续，EBV 抗体检测目前多数采用酶联免疫吸附法(ELISA)和全自动酶联免疫分析法，能动态反映EBV感染后的抗体水平,敏感度高,检测方法简单,主要用于传染性单核细胞增多症的诊断，对于EBV 相关淋巴组织增生性疾病的疗效判断和预防有一定帮助。缺点在于特异度不强，需要结合其他检查综合分析判断。

1.3 外周血EBV DNA定量检测 外周血EBV DNA是EBV 相关淋巴组织增生性疾病潜在的标志物，定量检测外周血EBV DNA 载量对EBV 相关淋巴组织增生性疾病诊断有重要参考价值[2],特别对于传染性单核细胞增多症和EBV（+）LPD 具有重要的意义。有研究表明EBV DNA 载量与EBV 相关淋巴组织增生性疾病严重程度有关，并且可以估计微小残留病灶，具有判断预后的价值[3-4]。目前有多种核酸诊断方法用于检测EBV DNA 及其病毒载量，包括半定量PCR，定量PCR（qPCR），实时PCR，实时定量PCR（RQ-PCR），荧光定量PCR（FQ-PCR），实时荧光定量PCR（RT-PCR）等。定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)以耗时少且准确性高成为目前应用最广泛的EBV DNA定量检测方法，其优点是敏感、可靠、特异、简便、快速[2]，能准确反映体内EBV感染复制情况，尤其EBV 急性感染。

2 不同淋巴组织增生性疾病外周血EBV DNA定量检测及临床意义

2.1 B细胞淋巴瘤

2.1.1 EBV阳性弥漫大B细胞淋巴瘤:2016版WHO淋巴造血肿瘤分类新修订种类：EBV 阳性弥漫大B细胞淋巴瘤[EBV(+)DLBCL]，在上一版中被命名为“青年人EBV(+)大B细胞淋巴瘤”。EBV（+）DLBCL 占亚洲国家DLBCL 病例的8%～10%，并且经常在50岁以上具有免疫能力的人中发现,与EBV(-)DLBCL 相比，EBV（+）DLBCL 具有侵袭性的临床行为。AU 等[5]通过qPCR检测发现EBV(+)DLBCL 病人外周血中均可以检测到EBV DNA，而EBV（-）DLBCL检测不到，且EBV DNA 在那些获得缓解的患者中其病毒载量下降到无法检测到的水平，在那些难治性疾病的患者中保持升高，并在疾病复发之前上升。2015年TISI 等[6]研究发现在EBV（+）DLBCL 中，检测外周血中的EBV DNA与较差的预后相关。MONTGOMERY 等[7]在马拉维的一组EBV（+）DLBCL 患者中采用RQ-PCR检测血浆EBV DNA 发现EBV DNA 载量高与总生存期（OS）降低有关。研究发现在37例EBER（-）DLBCL 中仍然有12例外周血EBV DNA检测到高拷贝数，提示许多DLBCL 患者的血浆EBV DNA 可能不是肿瘤来源。同样，在2017年，OKAMOTO 等[8]通过EBER 原位杂交和RQ-PCR检测患者血液中的EBV DNA 对比研究发现，在高达72%的EBER(-)患者中可以检测到EBV DNA，但是其EBV DNA 载量明显低于EBER(+)患者，EBV DNA 载量高于700copies/μg 患者的无进展生存期和总生存率显著低于EBV DNA 载量低于700copies/μg的患者，EBER(+)患者的病情进展更快，但是外周血EBV DNA 负荷较高的EBER(-)患者也会导致较差的无进展生存期和总体生存率，从而得出结论，诊断标本中的EBV DNA 载量不是EBER的简单替代，可能与DLBCL 预后有一定相关性。

2.1.2 伯基特淋巴瘤:伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma,BL)是一种高度侵袭性的B细胞淋巴瘤，其特征在于MYC（一种多效性的转录调节因子）重排，高增殖率。已知BL的三种流行病学类型：地方性，散发性和免疫缺陷相关性，这三种类型在形态和主要染色体变异方面相似，但是，在地理分布、流行病学、分子发生机制以及与EBV的关联方面都有差异。地方性伯基特淋巴瘤主要发生在非洲地区，超过90%的病例中可检测出EBV，STEVENS 等[9]采用RQ-PCR检测出BL 患者全血样品中的EBV DNA 载量为1.4×104～4.5×106copies/ml，相应的血清样本中EBV DNA载量在4.4×103～1.0×106copies/ml范围内,表明BL 患者的细胞内和体液中都可能存在EBV 负荷，但主要部分位于细胞内，所以血清EBV水平远低于全血EBV水平，从而认为血清不宜作为监测EBV DNA 载量的临床标本。SOLASSOL 等[10]对1例21岁腹型EBV（+）BL 患者采用RQ-PCR 技术监测诊断时和随访期间血浆、白细胞、腹腔细胞、腹腔积液和脑脊液中的EBV DNA载量,发现EBV DNA 载量与化疗后患者的临床和生物学缓解状态有较好的相关性，证实了血浆和外周血EBV DNA定量可作为BL的肿瘤载量标志物，可用于EBV（+）BL的监 测。KABYEMERA 等[11]采用qPCR检测坦桑尼亚西北部BL 患儿外周血EBV DNA 负荷，发现其病毒载量（988～6 250 164 copies/ml）明显高于对照组（1 290～19 452copies/ml），研究表明血液中高水平的EBV DNA 载量与预后以及化疗结果有关。VELAVAN 等[12]发现患有疟疾的儿童和孕妇的血浆中EBV DNA水平高于没有疟疾感染的儿童和孕妇，表明在疟疾发作期间EBV DNA 复制增加,这可能是由于恶性疟原虫与EBV感染的B细胞相互作用所致。这些发现进一步支持了EBV 病毒载量与eBL（热带非洲地区特有的伯基特淋巴瘤）的发生有关。

2.1.3 淋巴瘤样肉芽肿：淋巴瘤样肉芽肿病(lymphomatoid granulomatosis,LyG)是一种罕见的与EBV感染相关的B淋巴细胞增生性疾病，病因至今不明,可能为EBV 与B细胞CD20 受体结合,激活编码一系列加强EBV感染及B细胞增殖的产物[13]。病理上主要是以血管为中心并伴血管破环,以及EBV(+)异型性B细胞和大量反应性T细胞为特点。主要累及肺部,其次常侵犯皮肤和中枢神经系统等，临床上约10%～15%将最终转化为淋巴瘤,由于临床发病罕见，目前相关报道多为个案。OCHI 等[14]采用RQ-PCR检测一例淋巴瘤样肉芽肿患者血液中EBV DNA，其载量高达220copies/ml(正常<100copies/ml)。COSTINIUK 等[15]对一例HIV（+）淋巴瘤样肉芽肿患者采用qPCR 方法检测到其外周血EBV DNA 载量升高至12 434copies/ml，但其脑部病变中EBV DNA 载量低于检测线。淋巴瘤样肉芽肿临床特点常不典型，目前诊断主要依赖于病理活检，而外周血EBV DNA 拷贝数在该病中的作用仍需进一步研究。

2.2 T细胞淋巴瘤

2.2.1 NK/T细胞淋巴瘤：NK/T细胞淋巴瘤（NKTCL）是一种具有高度侵袭性的疾病，其发病构成约占所有非霍奇金淋巴瘤（NHL）的15%，在我国该类肿瘤约占所有NHL的23%。NKTCL最常发生在鼻腔，其发病原因尚无明确研究结果，目前发现其与EBV感染有密切联系，在多数患者的肿瘤组织和血液中能够检测出EBV DNA。张静等[16]采用RT-PCR检测NKTCL 患者外周血EBV DNA 载量，发现其外周血白细胞EBV DNA 载量(2.58×105～8.11×106copies/ml)高于外周血血浆EBV DNA 载量(1.52×105～9.72×106copies/ml)。研究证实了血液中EBV DNA检测作为辅助诊断NK/T细胞淋巴瘤和评估患者预后的参考指标具有一定的临床应用价值。KWONG 等[17]对56例NKTCL 患者230个SMILE 疗程中采集的910份血浆样本进行EBV DNA定量检测发现EBV DNA 载量的中位数为1 900(0～1.4×107)IU/ml，EBV DNA 载量和治疗反应显著相关。FEI 等[18]进行荟萃分析发现治疗前EBV DNA 阳性与NKTCL的总体存活率显著相关，治疗前EBV DNA 阳性的患者预后较治疗前EBV DNA 阴性的患者差，证实评估治疗前EBV DNA 载量可以预测淋巴结外NKTCL 患者的不良预后。SUZUKI等[19]研究发现治疗前血浆EBV DNA 似乎比PBMC测量更能反映临床分期、B 症状（超过38℃的发热、夜间大汗、就诊前6个月内体重降低超过基线体重的10%）、临床状态和预后，提示血清EBV DNA检测可作为判断NKTCL 总体存活率的重要指标。CHO 等[20]发现缓解后循环EBV DNA的阳性转化可能是在治疗后EBV DNA 阴性的情况下完全缓解的NKTCL 患者复发和亚生存率的重要预测指标,循环EBV DNA 载量较高与复发显著相关。KIM 等[21]研究同样表明血浆EBV DNA水平可为EBV感染提供直接证据，是监测NK细胞淋巴瘤疾病进展和评估预后的重要指标。定量检测EBV DNA 载量在EBV(+)NKTCL的诊断和鉴别诊断中发挥重要作用,对评估EBV+NKTCL（鼻型）的治疗效果和预后判断有一定作用，血浆中EBV DNA 可用作评估其严重程度或预后的生物标志物[22]。

2.2.2 血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤：血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤（Angioimmunoblastic T-cell lymphoma,AITL）是一种特殊的外周性T细胞淋巴瘤，多发于中老年人，临床表现为全身淋巴结肿大，发热，肝脾肿大，常出现胸腔积液和腹腔积液，已知AITL和EBV感染有关，在大多数AITL 病例的淋巴结和骨髓中都可以检测到EBV（+）B 免疫母细胞。ZHOU 等[23]通过RT-PCR检测到的EBV 和HHV6（人疱疹病毒）载量在AITL的发生发展过程中有一定作用，但两种病毒最高载量是互斥的。DELFAU-LARUE 等[24]证明了外周血中EBV DNA的存在与循环中的AITL 肿瘤细胞密切相关，疾病初期出现较高水平的外周血EBV DNA 载量对常规治疗存在不良反应。LIANG 等[25]对60例AITL 患者采用RQ-PCR检测外周血EBV DNA 发现，治疗前EBV DNA 阳性组（EBV DNA 载量范围为为8.36×103～5.58×106copies/ml）的总生存率比EBV DNA 阴性组差，EBV DNA检测阳性是三年无进展生存率和总生存率的独立预后指标，EBV DNA 载量的减少与治疗反应相关。

2.3 霍奇金淋巴瘤 霍奇金淋巴瘤（HL）是一种起源于生发中心或生发中心后B淋巴细胞的肿瘤，是一种独特的淋巴瘤亚型，患者男性多于女性，在欧美国家具有双峰疾病分布，分别在15～39岁和50岁以后，而包括中国在内的东亚地区，发病年龄则多在30～40岁之间，呈单峰分布。90%的HL 以淋巴结肿大为首诊症状，多起始于一组受累的淋巴结，以颈部和纵隔淋巴结最常见，患者初诊时多无明显全身症状，20%～30%的患者可伴有B 症状，此外还可以有瘙痒、乏力等症状。根据2016年WHO 淋巴造血组织肿瘤的分类，HL分为结节性淋巴细胞为主型和经典型HL 两大类型，其中结节性淋巴细胞为主型少见，约占HL的5%，经典型HL 可分为4种组织学亚型:淋巴细胞为主型(LP)、结节硬化型(NS)、混合细胞型(MC)和淋巴细胞消减型(DL)。EBV感染与HL组织学类型有关,混合细胞病病例中更为常见。HL 病理特征是在炎性浸润的背景下存在HRS 细胞。研究发现约30%～50%的HL 病例可原位杂交检测出EBV感染。GANDHI 等[26]采用qPCR检测HL 患者外周血EBV DNA，发现进入缓解期的成年和儿童HL 患者血浆EBV DNA 载量显著降低至低水平或无法检测到，而治疗反应较差的患者疾病进展与EBV DNA水平迅速升高有关。PARK 等[27]报道在韩国HL 患者中，全血中EBV DNA 阳性可能是三年无事件生存期（EFS）和总生存期（OS）较差的重要预测指标。SINHA 等[28]采用RT-PCR检测印度南部33例成人HL 患者血浆中EBV DNA 载量，其中49%（16/33）的患者血浆中（病毒载量为1.0×103～51.2×103copies/ml）治疗前可检测到EBV DNA，研究发现血浆EBV DNA 载量评估可能有助于诊断EBV（+）HL 并监测其对治疗的反应。DINAND 等[29]采用qPCR检测发现19例HL 患者中外周血EBV DNA 载量为5×102～4.3×105copies/ml，但在开始治疗后不久后便无法检测到，从而认为在HL 诊断时，血浆EBV DNA 载量是疾病活动和预后的相关生物学指标,具有晚期疾病、较高预后评分和B 症状的HL 患者血浆中EBV DNA 载量较高。

2.4 EBV 阳性淋巴组织增殖性疾病 EBV 阳性淋巴组织增殖性疾病（EBV+LPD）是指EBV 阳性的具有谱系的一组淋巴组织疾病，是一种全身性系统性淋巴组织病变，临床表现常出现全身淋巴结肿大、高热、肝脾肿大，病程至少3个月以上，血清EBV抗体滴度或EBV DNA 载量升高等，该病根据临床病理特征又分为三种：1 级（良性）、2 级（交界性）、3 级（肿瘤性）。EBV（+）LPD分为EBV（+）B淋巴细胞增殖性疾病以及EBV（+）T/NK细胞增殖性疾病，本病临床上又称为慢性活动性EBV感染（CAEBV),几乎所有患者血清病毒学检测显示外周血EBV DNA 载量升高或抗EBV 抗体阳性。骨髓穿刺细胞学检查提示增生性骨髓象，目前其发病机制尚不清楚。JUN-ICHI 等[30]比较了59例EBV（+）T/NK 淋巴组织增生性疾病患者血液成分中EBV DNA 负荷，发现血浆病毒载量明显更高。陈天明等[31]对13例EBV（+）LPD患儿行全血EBV DNA定量检测，发现患儿外周血EBV DNA 载量显著增高至1×108～1×1011copies/L。KAWAMOTO等[32]通过RQ-PCR检测在97.3%的CAEBV 中可检测到外周血EBV DNA 载量升高（≥2×102copies/ml），证实了外周血EBV DNA 载量升高对于诊断成人和小儿CAEBV 有用。最近，ARAI 等[33]报道，在CAEBV 中细胞毒性T细胞数量减少或显示功能障碍，其外周血中EBV DNA 载量较高。这些发现表明，不确定的免疫抑制疾病可能是T 或NK细胞持续感染的基础。目前血液中EBV DNA 载量定量是CAEBV 疾病谱的有用诊断标记，已被广泛用于诊断CAEBV。

2.5 传染性单核细胞增多症 传染性单核细胞增多症(infectious mononucleosis，IM)是一种由EBV 引起的急性自限性淋巴增生性疾病。典型特征包括发热、咽扁桃体炎、颈部淋巴结病变、脾肿大、亚临床型肝炎和不典型淋巴细胞增多症。IM 多发生在年龄较大的儿童和青少年中，一般预后良好。其特征是外周淋巴细胞增多和存在循环性非典型淋巴细胞。ARAI 等[34]在一例22岁IM患者急性期通过qPCR检测外周血单个核细胞EBV DNA，其载量升高至2.3×105copies/ug，病情逐渐好转后EBV DNA载量降至24copies/ug。IKUTA等[35]通过qPCR 在13例血清EBV 抗体(-)IM 婴儿中发现8例PBMC中检测到EBV DNA，表明qPCR 对EBV 抗体检测(-)的IM 婴儿诊断有重要意义。CAO 等[36]通过对38例IM患者采用不同EBV检测方法，即荧光原位杂交（FISH）、实时PCR 与血清学抗体检测，发现FISH 和实时PCR 比血清学抗体检测更为敏感，检测血液中EBV DNA 载量比FISH检测法更可取，并且优于血浆实时PCR，因为它反映了患者体内循环的绝对病毒负荷。喻晶等[37]采用FQ-PCR研究发现患者血浆中EBV DNA 载量均值明显超过了血液淋巴细胞，但是血浆中EBV DNA 载量大于105copies/ml时才可以检出，这可能是感染初期血浆中EBV DNA 载量极低或检测不到的原因，当疾病进入进展期，受感染淋巴细胞中的EBV DNA 大量复制裂解释放入血，此时便可以在血浆中检测到EBV DNA。大量相关研究表明qPCR检测外周血EBV DNA 可作为一种鉴别IM患者的简单方法。

2.6 EBV 阳性皮肤黏膜溃疡 EBV 阳性皮肤黏膜溃疡（EBV-positive mucocutaneous ulcer,EBV+MCU）是2016年WHO 造血与淋巴组织肿瘤分类中新增的一个暂定类型，临床上，EBV(+) MCU 发生于浅表、边界清晰的单灶性黏膜或皮肤溃疡，主要见于免疫抑制患者，包括年龄较大、医源性免疫抑制、原发性免疫紊乱和HIV/AIDS 相关的免疫缺陷患者等[38]。EBV（+）MCU的组织学特征是EBV 阳性，多形性浸润的背景中可见异型的大细胞，部分为霍奇金样和HRS 样大细胞,外周血EBV DNA 阴性。DOJCINOV 等[39]最早报道EBV（+）MCU，研究发现该病临床过程具有自限性、惰性的特点，HART 等[40]在70例EBV(+)移植后淋巴组织增殖性疾病（PTLD）患者中发现7例EBV（+）MCU，其中包括5例肾脏、1例心脏和1例肺脏移植，其外周血EBV DNA 均为阴性。目前EBV（+）MCU 国内外文献罕见，其与EBV DNA的关系有待进一步研究。

3 结语

综上所述，EBV 与淋巴组织增生性疾病关系密切，EBV DNA 可在EBV 相关淋巴增生性疾病患者外周血单核细胞、血浆、全血和组织标本中进行定量，定量聚合酶链反应（qPCR）操作方便，极其灵敏，能够快速准确重复检测病毒载量，更精准地反映EBV感染和病毒复制情况。近年来，EBV DNA 载量评估已在临床实践中广泛用于诊断和监测EBV相关淋巴组织增生性疾病，监测外周血EBV-DNA负荷可提供一种监测EBV 相关淋巴组织增生性疾病患者体内EBV感染状态的简单方法，已成为诊断EBV 相关淋巴组织疾病的重要工具。目前，EBV 在不同淋巴组织增生性疾病中的检出率不同，外周血EBV DNA 拷贝数升高已成为传染性单核细胞增多症、EBV+LPD的确诊依据之一，同时EBV DNA定量检测可作为诊断、临床分期、治疗指导以及评估部分EBV 相关淋巴瘤进展及预后情况的重要参考指标。