2型糖尿病微血管并发症患者血清miR-152，β2-GPI/ox-LDL和β2-GPⅠ-Lp(a)水平联合检测的价值研究

李 凌，王 成，王 静，陈小伟（.南京市六合区人民医院检验科，南京500；.中国人民解放军东部战区总医院检验科，南京000）

2型糖尿病（type 2 diabetes，T2DM）是一种以糖代谢障碍为主要特征的慢性炎症性疾病，现已成为危害我国人类健康的主要原因，其发病机制尚不完全清楚。T2DM患者血糖长期控制不佳易诱发相关微血管并发症（type 2 diabetes associated microvascular complications，T2DMC），是T2DM患者致残、致死的主要原因，对患者生活质量和生命造成极大威胁，然而目前临床尚缺乏T2DMC 风险预测和诊断有价值的血清学标志物[1]。大量研究显示，微小核糖核酸（microRNA，miRNA）在T2DM 及其相关的微血管并发症发生、发展中发挥重要作用，其可通过对胰岛β 细胞、微血管内皮细胞生理病理功能进行调节，参与细胞功能障碍和损伤[2]。肥胖导致的脂代谢异常是T2DM 发生发展的主要危险因素，其中，氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）和脂蛋白a [Lp(a)]可与载脂蛋白H（β2-GPI）形成稳定的复合物β2-GPI/ox-LDL和β2-GP Ⅰ-Lp(a)，在T2DM患者血管损伤中发挥关键作用[3]。此外，miRNA表达异常与脂代谢紊乱之间也存在紧密联系。miR-152是一种胰腺发育相关的miRNA，与胰岛β 细胞分化、凋亡及胰岛素分泌相关[4]；同时，miR-152 在脂代谢过程中也发挥重要作用[5]。然而，miR-152 在T2DMC患者外周血中表达变化尚不清楚，且其与患者血清β2-GPI/ox-LDL和β2-GP Ⅰ-Lp(a)水平相关性及联合检测作为T2DMC 诊断指标价值亦未见报道。本研究通过检测T2DM 及T2DMC患者血清中miR-152，β2-GPI/ox-LDL和β2-GP Ⅰ-Lp(a)的水平，探讨miR-152 变化特征及其联合检测β2-GPI/ox-LDL和β2-GP Ⅰ-Lp(a)对T2DMC的临床诊断价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2013年1月～2018年12月在南京市六合区人民医院和东部战区总医院收治的79例T2DM（男性49例，女性30例，年龄48.9± 13.4岁）及78例T2DMC（男性52例，女性26例，年龄52.1 ± 12.8岁）患者，其中T2DM 按照世界卫生组织（WHO）制定的入选标准：空腹血糖≥7.0 mmol/L和/或餐后2 h 血糖≥11.1mmol/L和/或糖化血红蛋白（HbA1c）≥ 6.5%；T2DM 伴相关微血管病变组（T2DMC）入选标准：患有T2DM并被诊断有糖尿病肾病或糖尿病神经病变或糖尿病视网膜病变的患者。排除标准：近一个月内使用过降糖药物治疗；近期接受手术治疗患者；有严重肝脏疾病或慢性肾功能不全；其他内分泌疾病患者。选取同期在上述医院体检中心行体检的健康对照者78例（男性45例，女性33例，年龄50.8 ± 14.8岁）。对照组、T2DM患者组、T2DMC患者组间年龄、性别差异均无统计学意义（均P>0.05）。患者及对照均用真空生化管采集空腹静脉血3～5 ml，1 500 g离心10 min 后取血清置于-70℃冰箱留存待用。

1.2 试剂和仪器 血清RNA 提取试剂酸性水饱和酚（美国Sigma-Aldrich 公司）；分析纯级别氯仿，异丙醇，无水乙醇（上海化学试剂公司）；3 mol/L（pH = 5.5）醋酸钠（美国Ambion 公司）；人工合成的miRNA 成熟体标准品（广州锐博生物科技有限公司）；miRNA 逆转录PCR buffer，AMV酶，dNTP mixture，实时荧光定量PCR buffer，rTaq酶，25mmol/L MgCl2（大连TAKARA 公司）；TaqMan miRNA检测试剂盒（美国Life technology 公司）；去除RNA 酶DEPC 水（美国Sigma-Aldrich 公司）；血生化指标包括空腹血糖（Glu）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）检测试剂（英国Randox 公司）；低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）检测试剂（日本第一化学株式会社）。普通PCR仪，7500型实时荧光定量PCR 仪（美国Applied Biosystem 公司），酶标仪（美国BioRad 公司），7600 全自动生化分析仪（日本HITACHI 公司）。

1.3 方法 血清RNA 提取、miRNA 逆转录及实时荧光定量PCR检测、反应体系和参数设置均按照文献报道的方法进行，通过标准曲线计算血清miRNA表达水平[6]。血清β2-GPI/ox-LDL和β2-GP Ⅰ-Lp(a)按参考文献[7-8]建立的ELISA 法测定，酶标仪检测波长为450 nm。运用7600 全自动生化分析仪按照操作规程及试剂说明书对患者及对照血清生化指标进行测定。

1.4 统计学分析 数据分析用Graphpad 7.0 软件和SPSS 23.0 统计软件进行。正态分布的数据用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；非正态分布的数据以中位数（四分位数间距）[M（P25,P75）]表示，两组间比较采用非参数Mann-WhitneyU检验。运用ROC曲线分析评估血清miR-152，β2-GPI/ox-LDL和β2-GP Ⅰ-Lp(a) 对 于T2DM及其相关微血管病变的诊断价值，进一步结合二元逻辑回归分析三者联合检测的诊断价值。血清miRNA水平与氧化脂蛋白相关复合物、其他生化指标的相关性用Spearman 秩相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组间血清miR-152，β2-GPI/ox-LDL和β2-GPI-Lp(a)表达水平分析 见表1。与健康对照组相比，miR-152，β2-GPI/ox-LDL和β2-GP Ⅰ-Lp(a)水平在T2DM 和T2DMC患者血清中上调，差异均有统计学意义（均P<0.01）。同时，血清miR-152 和β2-GPI/ox-LDL 在T2DMC组中水平亦高于T2DM组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 不同组间血清miR-152，β2-GPI/ox-LDL和β2-GPI-Lp(a)表达水平比较[M(P25,P75)]

2.2 血清miR-152，β2-GPI/ox-LDL和β2-GPI-Lp(a)水平对T2DMC的诊断价值 见图1。ROC曲线分析发现，血清miR-152，β2-GPI/ox-LDL和β2-GP Ⅰ-Lp(a)诊断T2DM组患者的ROC曲线下面积分别为0.847（95% CI：0.785～0.908），0.644（95%CI：0.558～0.730）和0.700（95% CI：0.619～0.782）；诊断T2DMC组患者曲线下面积分别为0.899（95%CI：0.847～0.950），0.785（95% CI：0.716～0.855）和0.718（95% CI：0.619～0.782）；三者联合诊断T2DM 和T2DMC组患者曲线下面积分别为0.923（95% CI：0.882～0.964）和0.963（95% CI：0.934～0.992），其价值均高于单一指标。同时，三者联合检测对于T2DM 和T2DMC组患者还具有一定的鉴别诊断价值0.677（95% CI：0.592～0.762）。

图1 血清miR-152，β2-GPI/ox-LDL和β2-GPI-Lp(a)及三者联合诊断ROC曲线

2.3 相关性分析 见表2。Spearman 相关分析结果显示，在T2DM 和T2DMC组患者中，血清β2-GP1-Lp(a)与TC 和TG水平均呈正相关（r=0.215，0.203，均P<0.05），血清miR-152，β2-GPI/ox-LDL和β2-GP Ⅰ-Lp(a)组合与LDL水平呈正相关（r=0.188，P<0.05）。

表2 T2DM 和T2DMC患者血清miR-152，β2-GPI/ox-LDL和β2-GPI-Lp(a)及其联合检测与生化指标相关性分析

3 讨论

T2DMC 尚缺乏有价值的血清学标志物，临床诊断和病情监控较为困难。大量研究显示，miRNA在T2DM 及T2DMC 发生、发展中发挥重要生理病理功能，且外周血中存在丰富、稳定表达的miRNA，是一类新型的T2DM 及其相关并发症潜在生物标志物[9-10]。同时，脂代谢异常作为T2DM发生的危险因素，亦与T2DMC 发生密切相关，且外周血血脂异常与miRNA 特别是循环miRNA表达异常同样存在相关性，二者可共同作用参与T2DMC 发生发展。但目前关于外周血miRNA 及异常脂蛋白与T2DMC 关系的研究仍较少，二者联合检测作为T2DMC 生物标志物的研究未见报道。本研究针对在胰岛β 细胞和微血管内皮细胞生理病理功能中发挥重要作用的miR-152，发现其在T2DM 及T2DMC患者血清中表达水平较对照显著升高，且在T2DMC患者升高更为显著，是T2DMC患者潜在的诊断标志物。同时，与健康对照相比，β2-GPI-ox-LDL和β2-GPI-Lp(a)水平在T2DM 和T2DMC患者血清也显著升高。miR-152联合β2-GPI-ox-LDL和β2-GPI-Lp(a) 对于T2DMC诊断具有较高的敏感度和特异度，其诊断价值明显优于单一指标检测，可有效弥补单指标检测不足，三者联合检测是T2DMC 具有潜在应用价值的诊断标志物。

本研究发现miR-152 在T2DM 及T2DMC患者血清中表达水平较对照均显著升高，且在T2DMC患者升高更为显著，提示其既参与T2DM 发生发展，又与微血管内皮损伤密切相关。研究显示，miR-152对于胰岛素分泌具有重要调节作用，高血糖患者和糖尿病大鼠胰岛组织中miR-152的表达水平均明显上调，进一步分子机制研究发现miR-152 可通过抑制丙酮酸脱氢酶E1α 和葡萄糖激酶表达，导致胰岛β 细胞内ATP/ADP 比例降低，进而引起β 细胞分泌能力降低、细胞功能障碍和T2DM的发生[11]。同时，经二甲双胍药物治疗后的T2DM患者血浆miR-152水平与治疗前相比显著降低，也进一步证实miR-152表达与β 细胞分泌功能及胰岛素水平密切相关[12]。miR-152 还被报道与T2DM 微血管并发症的发生相关。XU 等[13]发现，miR-152 可通过调控同源性磷酸酶-张力蛋白（PTEN）参与糖尿病足损伤发生发展，抑制miR-152的表达可促进糖尿病足损伤修复。ROUX 等[14]发现糖尿病肾病患者血浆miR-152水平较T2DM患者及健康对照明显升高，且与血浆渗透压呈现出显著正相关，miR-152 可能通过调控SLC5A3 蛋白表达影响血浆渗透压，进而参与糖尿病肾病发生。此外，miR-152 还可通过调控血管内皮生长因子（VEGF）和转化生长因子β1（TGFβ1）的表达抑制人视网膜内皮细胞（human retinal endothelial cells，hRECs）和视网膜微血管内皮细胞（retinal microvascular endothelial cell line，hRMECs）增殖和血管新生，导致糖尿病视网膜病变的发生[15]。

脂代谢异常是T2DM 及T2DMC 发生发展的主要危险因素[16]。本研究发现β2-GPI-ox-LDL和β2-GPI-Lp(a)水平在T2DM 和T2DMC患者血清显著升高，其可能与患者高糖高脂导致的氧化应激压力有关，并在糖尿病微血管病变发生过程中发挥重要病理作用。既往研究显示，肾病综合征患儿和急性冠脉综合征患者血清β2-GPI-ox-LDL和β2-GPILp(a)升高，与血管内皮损伤相关[17-18]。本研究结果则发现T2DM患者β2-GPI-ox-LDL和β2-GPILp(a)升高，且在T2DMC患者升高更为显著，也进一步证实了二者与糖尿病微血管病变发生密切相关。本研究还发现，血清miR-152，β2-GPI/ox-LDL和β2-GPI-Lp(a)组合与LDL水平呈正相关，提示三者可能存在交互作用，共同参与糖尿病及其微血管病变发生。FAN 等[5]研究发现，miR-152 可通过调控脂肪酶表达抑制脂肪前体细胞增殖，促进细胞分化，脂肪形成和肌内脂肪形成；YANG 等[19]发现上调乳腺上皮细胞miR-152表达可显著促进三酰甘油形成。上述研究均提示高表达miR-152 与脂代谢异常相关。同时，脂代谢异常亦可导致miR-152表达上调。WU 等[20]发现，肥胖患者血清miR-152水平较健康对照显著升高。本研究发现，miR-152联合β2-GPI-ox-LDL和β2-GPI-Lp(a) 对于T2DMC诊断价值明显优于单一指标检测，也进一步提示了miR-152，β2-GPI-ox-LDL和β2-GPI-Lp(a)可能相互促进和调节，共同参与T2DM 和T2DMC的发生、发展，但其具体分子机制仍需后续深入研究。

综上所述，T2DM 和T2DMC患者血清miR-152，β2-GPI-ox-LDL和β2-GPI-Lp(a)水平较健康对照均显著升高，三者联合检测对于T2DMC 诊断具有较高的灵敏度和特异度，可有效弥补单指标检测不足，是T2DMC 潜在的辅助诊断标志物，同时，miR-152，β2-GPI-ox-LDL和β2-GPI-Lp(a)可能相互促进和调节，共同参与T2DM 和T2DMC的发生发展。