miRNA对畜禽肌肉生长发育调控的研究进展

胡志刚，曹俊婷，张建勤，张慧林，刘小林

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

骨骼肌占脊椎动物体质量的40%～60%，对机体运动和代谢平衡很重要。肉类产量和质量是畜禽养殖业考虑的重要因素。随着人们对肉产品需求的不断增加，畜禽的研究主要集中在提高肌肉生长速度、肌肉质量和产量等方面。除营养和环境因素外，畜禽的遗传也是决定骨骼肌生长发育的重要因素。在肌肉形成的过程中，肌源性前体细胞迁移到肌肉形成的适当部位(如四肢)后开始增殖。之后肌肉前体细胞退出细胞周期，融合形成肌管进而形成多核肌纤维。动物肌肉产量在很大程度上取决于肌纤维的增生和肥大，而这些复杂的发育过程依赖于精确的时空网络，该网络在多个水平上调控转录因子，包括mRNA的转录和翻译、蛋白质的稳定性和降解等。MicroRNA(miRNA)参与生物发育和代谢的各个方面，包括细胞增殖、分化、凋亡等发育调控机制。miRNA通过识别位于靶mRNA的3′非翻译区(3′ UTR)中的特异性互补序列，在很大程度上抑制转录后的基因表达(包括mRNA降解，抑制翻译起始和延伸)[1]。

1 肌肉的形成机制

骨骼肌起源于哺乳动物和鸟类的肌节。早期的胚胎肌纤维形成发生在不同的阶段，即脊椎动物要经历3次肌生成(胚胎期、胎儿期和成年期)，才能形成最终成熟的肌肉。胚胎期肌生成产生身体的第1个肌肉纤维(初级纤维)，其作用是定义肌肉的类型、形状或位置，但不决定肌肉质量。在胎儿期肌生成过程中，胎儿成肌细胞融合并产生围绕初级纤维的次级纤维(胎儿纤维)。次级纤维的形成对成熟肌肉中肌纤维的数量有很大的影响[2]。成年期的肌发生过程与肌肉再生有关，即在没有损伤的情况下，个体在出生后不会形成新的肌纤维，肌肉质量的增加主要是由于肌纤维变粗变长所致[3]。位于肌纤维基膜和质膜之间的肌源性细胞，即卫星细胞(satellite cells,SCs)，是动物出生后影响肌肉肥大和再生的主要因素。

骨骼肌的形成和再生是一个复杂且受调控的过程，涉及肌肉前体细胞的激活、增殖和分化，并且肌生成过程受到生长因子和转录因子的时空调控。肌肉祖细胞定向分化为成肌细胞的过程，需要经过增殖、分化并融合形成多核肌管，最终形成成熟的肌纤维。生肌调节因子家族(MRFs)主要调控成肌细胞的增殖和分化，最终形成成熟的骨骼肌细胞。在肌肉成熟后，肌肉祖细胞进入静止期，形成SCs。肌肉祖细胞的特征是表达Pax3(paired box 3)和Pax7(paired box 7)，其中Pax3调控MRFs的转录，并在胚胎发育早期促进细胞向成肌细胞分化[4]。Pax7是动物出生后肌肉发育的标记基因，通过与细胞生长，黏附等相关的特定基因结合而促进细胞增殖并抑制其分化。在胚胎期，Pax7参与SCs的增殖并将其融合为肌管，同时也促进动物出生后肌纤维的肥大。畜禽出生后肌纤维的数目不再增加，但肌纤维会变粗增长，这是DNA转录和翻译增加的直接结果，即蛋白质合成的增加。为了获得更多蛋白质合成，就要求细胞核数量增多，此时位于肌纤维细胞膜和基膜之间的SCs发挥了重要作用。SCs分裂后与相邻的肌纤维相互融合，提供细胞核。当蛋白质合成率高于降解率时，就会导致肌纤维的肥大，从而增加肌肉的产量。

2 miRNA作用机制

miRNA是单链非编码RNA，在转录后负调控基因的表达。miRNA最初由RNA聚合酶II转录为长的初级pri-miRNA转录物，然后通过包含Drosha和DGCR8/Pasha的多蛋白复合物处理形成具有茎环结构的前体pre-miRNA。pre-miRNA被核输出因子Exportin 5转运至细胞质中，由RNase Dicer裂解成约22 nt的双链miRNA中介体。随后其中1条链在解旋酶的作用下解链，最终形成单链的miRNA。miRNA分子与Argonaute蛋白结合形成RNA诱导沉默复合物(RISC)，沉默特定的miRNA靶基因。基因沉默是由碱基配对产生的，即miRNA与靶基因的作用大多是靶向作用在目标基因的3′UTR上，引起下游基因的翻译抑制(不完全匹配)或使靶mRNA降解(完全配对)[5]。

3 miRNA对畜禽肌肉生长发育的调控

在胚胎期肌生成过程中，Dicer的特异性失活会引起围产期致死率、肌肉质量降低和肌纤维形态异常，这使得miRNA成为胚胎肌肉发育的关键调控因子[6]。3种肌肉特异性miRNA：miR-1、miR-133和miR-206在调节肌生成过程中起着关键作用。miR-1和miR-133聚集在同一个染色体位点上并一起转录，进一步加工会产生2个独立成熟的miRNA，但它们在骨骼肌增殖和分化中的作用截然不同。miR-133通过抑制血清反应因子(SRF)促进成肌细胞增殖，而miR-1通过靶向抑制组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)促进肌生成[7]。miR-206还通过靶向抑制DNA聚合酶α亚基(Pola1)、连接蛋白43(Cx43)、卵泡抑素样1(Fstl1)和促性腺激素(Utrn)的表达来抑制DNA的合成，促进细胞周期的退出和最终肌细胞的分化[8-10]。miR-181通过靶向成肌细胞终末分化的抑制因子Hox-A11，参与MyoD的诱导和肌肉标志物的表达[11]。此外，miR-214、miR-208、miR-195和miR-29等在肌肉中特异性、非特异性或暂时性表达，并参与骨骼肌或心肌细胞的增殖或分化[12-15]。同样，miR-26a、miR-322、miR-424、miR-378、miR-486和miR-503能加速成肌细胞肌管的形成和肌源性标记物的表达。目前，随着高通量测序技术的广泛应用，越来越多的畜禽骨骼肌miRNA及其下游靶基因被鉴定出来，并从个体或细胞水平研究其功能。

3.1 miRNA调控家畜肌肉生长发育miR-133和miR-206作为最常见的调控肌肉生长发育的miRNA，其调控作用已在牛肌肉中得到证实。研究发现miR-133b能促进牛骨骼肌SCs的增殖[16]，而miR-206对牛骨骼肌SCs有促进分化的作用[17]。在多种组织中都广泛表达的miR-181a能促进牛骨骼肌SCs的分化[18]。miR-2425靶向调节RAD9A和MYOG，进而促进牛骨骼肌SCs的增殖，并抑制其分化[19]。此外，魏雪峰[20]研究发现，miR-378a-3p通过靶向HDAC4来调控牛肌细胞的增殖、分化及凋亡；miR-107通过调控靶基因Wnt3a来抑制牛肌细胞的增殖和分化。张伟伟[21]构建了不同阶段牛骨骼肌SCs分化的差异miRNA表达谱，发现靶向调控MyoG基因的miRNA有65个，其中miR-2400是牛中特异表达的miRNA，其负调节MyoG的表达，促进骨骼肌SCs的增殖。王轶敏[22]筛选得到15个牛肌肉SCs成肌分化过程中显著差异表达的miRNA，其中miR-1、miR-206、miR-128、miR-133a、miR-133b、miR-143、miR-145、miR-193b、miR-139、miR-378、miR-378b、miR-378c上调表达，miR-222、mi R-335和miR-376e下调表达。孙加节[23]利用深度测序的方法鉴定了胚胎期90，200 d，出生后5 d，12月龄及24月龄秦川牛背部肌肉miRNA表达规律，共发现510个miRNA，其中有263个miRNA在5个时期都表达；同时在秦川牛肌肉组织中共预测得到125个新的miRNA，其中4个在5个时期中都表达。有14个miRNA在出生后肌肉组织中的表达显著上调，而有22个miRNA在出生前肌肉组织中的表达显著上调。

有研究表明，miR-1和miR-133在山羊心脏和背最长肌中高表达，在其他组织中低表达。并且山羊骨骼肌中miR-1的表达随着个体的发育开始减少，而miR-133的表达则显著增加。此外，miR-1和miR-133通过负调控靶基因HDAC4和SRF对山羊骨骼肌发育进行调控[24-25]。宋广超等[26]研究了miR-133前体在不同绵羊骨骼肌中的多态性，结果发现绵羊miR-133前体序列的SNP(g.54047535)位点可能影响miR-133前体的加工和成熟，从而影响绵羊的产肉性能。为研究绵羊骨骼肌中miRNA的表达情况，ZHAO等[27]在绵羊骨骼肌中检测到2 396 个miRNA。其中，miR-192的过表达能显著抑制SCs的肌源性分化，促进SCs的增殖。相反，抑制miR-192的表达则促进SCs的分化并抑制SCs的增殖。此外，miR-192靶向视网膜母细胞瘤1(RB1)起作用，而RB1是一种已知的肌生成调节因子。

杨雪梅等[28]探究miRNA与猪肌肉品质的调控关系，研究结果表明miR-1、miR-27a、miR-369、miR-378在藏猪、成华猪、雅南猪、丫杈猪、青峪猪、内江猪和乌金猪背最长肌中的表达相似，4种miRNA均正调控猪肉品质，负调控猪胴体品质。刘晓琴[29]研究发现miR-378通过抑制BMP2和MAPK1的表达来调控猪骨骼肌的生长发育。王晓燕[30]的研究证实miR-499-5P能抑制Sox6的表达，从而调节猪骨骼肌慢肌纤维的形成。与此相同的是，miR-208b和miR-499已被证实具有促进氧化型肌纤维的形成，抑制酵解型肌纤维形成的作用[31]。王言等[32]研究了miRNA的表达与猪背最长肌肉质风味的相关性，发现miR-23a、miR-151与猪肉品质正相关，而miR-199a、miR-299和miR-497与猪胴体品质正相关。目前，通过高通量测序鉴定出越来越多猪肌肉发育相关的miRNA，不仅丰富了猪肌肉miRNA数据库，也为深入了解其功能提供了研究基础。不同猪种间miRNA的表达存在差异，SHENG等[33]分析了大白猪和民猪在出生后60，120，150，180 和210 d背最长肌的miRNA，共鉴定出734个miRNA，包括308个有注释的miRNA和426个新的miRNA，其中307个miRNA被认为是猪特有的。孙瑞萍等[34]比较分析了1月龄五指山猪与长白猪骨骼肌的miRNA，共获得318个己知猪的miRNA，其中五指山猪鉴定出312个已知 miRNA和83 个新的miRNA，长白猪鉴定出306个已知 miRNA和88个新的miRNA。此外，发现的17个差异显著的miRNA中16个miRNA表达上调，1个miRNA表达下调。

3.2 miRNA对家禽肌肉生长发育的调控let-7在组织器官发育中具有重要的调控作用。岳孝亭等[35]发现let-7b通过靶向调控IGF2BP3的表达来影响IGF2的转运、稳定和迁移，进而影响鸡成肌细胞的增殖。LUO等[36]研究结果表明miR-203在第10～16天(E10～E16)的鸡胚骨骼肌中会短暂上调，而在E16之后miR-203的表达急剧下调甚至不表达。此外，miR-203的过表达会抑制成肌细胞的增殖和分化，而其功能的丧失则促进了成肌细胞的增殖和分化。c-JUN和MEF2C对细胞增殖和肌肉发育起重要作用，在肌生成过程中，miR-203可以靶向并抑制c-JUN和MEF2C的表达。有研究表明gga-miR-206在金茅黑鸡肌肉发育中是显著上调基因。娄秋宏[37]研究表明金茅黑鸡腿肌中gga-miR-206的表达呈先升后降的趋势，在胚胎第16天时达到顶点，随后开始下降并在出生后又有所回升；胸肌中gga-miR-206的表达呈现下降趋势，在胚胎第10天时表达量达到最高，并在第16天时出现一个小高峰。为进一步探寻蛋鸡和肉鸡miRNA的表达差异，LI等[38]对肉鸡和蛋鸡骨骼肌进行了转录组分析，共鉴定了33个新的和189个已知的鸡miRNA。其中17个miRNA在肉鸡和蛋鸡之间存在差异表达，且这些miRNA的许多靶点与肌生成调控有关。WATCHARAPONG等[39]研究发现，与对照组(37.8℃)相比，在38.8℃条件下，胚胎期第7～10天鸡胸肌中miR-133的上调以及腿肌中miR-199a-5p、miR-1915和miR-638的下调在功能上与肌生成和体型有关。鸡胚胎期第10～13天，在36.8℃下孵化会导致与增殖和分化相关的let-7、miR-93和miR-130c的下调。高剑[40]发现miRNA的表达数目在藏鸡胚胎期随时间而逐渐递减，出壳后miRNA的表达数目趋于平稳。

不同生长阶段鸭肌肉的miRNA数量存在差异。GU等[41]分析了胚胎第13，19和27天北京鸭胸肌中miRNA的分布，共获得382个miRNA，包括359个已鉴定的miRNA和23个新的miRNA，并且发现北京鸭miRNA高度保守。let-7参与细胞的生长、分化和凋亡，徐铁山等[42]研究发现let-7-5p在北京鸭孵化第11～27天胸肌中的表达逐渐增加，其靶基因GO中的许多条目与骨骼肌发育密切相关。李欣欣[43]的研究表明miR-33a能通过靶向调控IGF-1、FST和CCND1的表达以及PI3K/Akt/mTOR信号通路来抑制鸭成肌细胞增殖。吴宁昭[44]研究发现miR-1通过靶向调控HDAC4来促进鸭成肌细胞的分化，miR-133则通过调节SRF、TGFBR1的表达来促进鸭成肌细胞増殖。

3.3 miRNA对水产动物肌肉生长发育的调控miRNA对水产动物肌肉生长发育具有重要的调控作用。miR-1和miR-133能促进斑马鱼肌肉基因的表达并调节肌节肌动蛋白[45]。DURAN等[46]的研究结果表明miR-1和miR-206调控Pacu(一种鱼类)成肌细胞的分化，而miR-133调控这些细胞的增殖。miR-499在慢肌肌肉中高度表达，表明其参与了慢肌肌纤维表型的鉴定。YAN等[47]在鲤鱼骨骼肌中鉴定出188个保守的miRNA和7个新的miRNA，其中miR-1、miR-21、miR-26a、miR-27a、miR-133a-3p、miR-206、miR-214和miR-222在鲤鱼骨骼肌发育过程中差异表达。CHU等[48]和张方亮[49]从中国鲈鱼和鳜鱼慢肌和快肌中分别筛选得到199和59个差异表达的miRNA，其中miR-103和miR-144分别负调控快肌和慢肌中SmyD1a和SmyD1b的表达，从而影响中国鲈鱼和鳜鱼肌肉的发育和性能。ZHAO等[50]研究发现miR-181b-5p通过降低罗非鱼MSTNb的表达来促进骨骼肌的生长。

4 展望

miRNA可以通过介导mRNA的降解或抑制翻译来调控靶基因的表达，已成为调节基因表达的重要参与者。在肌肉发育方面，miRNAs通过调控靶基因的表达来调节肌细胞生物学的重要过程，包括细胞增殖、分化、干细胞更新和维持等。尽管在过去的十几年中关于miRNA已经取得了许多重要的发现，但是由于转录因子、miRNA和它们的靶基因之间存在多种可能的相互作用，目前对miRNA在动物肌肉生长发育中的作用的认识仍然相当有限。未来的研究需要集中于鉴定、表征miRNA在脊椎动物肌肉发育功能，预测和验证其下游的靶基因，研究其具体的作用机制和相关信号通路。随着对miRNA研究的深入，对定向提高家养动物肌肉产量、生长发育速度和肉品质质量方面有着十分重要的意义。