成肌细胞原代培养及临床应用前景*

邱裕佳王伟*

成肌细胞原代培养及临床应用前景*

邱裕佳1王伟2,3*

成肌细胞（Myoblast）是肌组织中静止的单核细胞，肌纤维肌膜与基底膜之间，是肌细胞的前体细胞，在肌肉损伤修复过程中发挥重要作用。随着分子及细胞生物学的发展成肌细胞的特性逐渐被人们认识，如取材方便、来源广泛、体外增殖分化能力强、能与受体肌细胞融合并共享基因产物、移植后不会无限增殖或形成肿瘤、自体成肌细胞移植没有伦理争议等，因而成肌细胞被视为优良的种子细胞被应用于多种系统相关疾病的研究和治疗中。文章针对成肌细胞的原代分离、纯化、影响其增殖及分化因素、成肌细胞的临床应用前景等方面作以概述。

成肌细胞；原代培养；细胞治疗；

成肌细胞是骨骼肌中具有增殖分化潜能的成体干细胞，由Muaor（1961年）首次从青蛙骨骼肌纤维中分离出来。成熟个体骨骼肌组织中成肌细胞以肌卫星细胞形式存在，因其取材方便、增殖能力强、易于培养等优点而受到关注。随着研究的不断深入，成肌细胞已在心脏疾患、肌损伤和肌病、骨科学损伤修复等治疗领域，展示出广阔的临床应用前景。基于临床应用角度考虑，移植细胞应以自体来源为佳，但自体成肌细胞数量有限[1]难以满足临床应用供求需要。所以大量、优良的成肌细胞，是从事相关研究和临床应用开展的前提。

本文就成肌细胞培养涉及到的原代分离、纯化、影响其增殖及分化因素、成肌细胞的临床应用前景等方面加以概述。

1 成肌细胞原代分离方法

目前成肌细胞的分离方法趋于成熟。较为常用的方法有：酶消化法、组织块法和单根肌纤维法3种。

1.1 酶消化法

酶消化法是目前体外获得成肌细胞最常用的方法，骨骼肌成肌细胞经典培养方法为Blau等[2]的方法，即胰蛋白酶与胶原酶联合分步消化法分离成肌细胞。对此改进较多的是采用混合酶消化，减少消化时间，减轻酶对细胞的损伤，同时也就可以降低了酶的浓度，这样既节省了酶的用量也提高了细胞的存活率。后续不少研究人员应用该改进方式，并获得了较好的效果[3]。

1.2 组织块法

组织块法是利用的是成肌细胞被激活后具有迁移能力，能从组织块或肌纤维游离出来的特点，将1mm3肌组织小块接种于培养瓶，待成肌细胞从贴壁的组织块周围游离出来，达到合适密度进行消化传代。

1.3 单根肌纤维法

该方法剥离完整肌组织块，然后用酶消化肌组织释放肌纤维，随后成肌细胞便可游离出来[4,5]。适于研究成肌细胞的原始位置及其子代从肌纤维上的迁移、自我更新、增殖、分化和融合等过程，且获得的成肌细胞再生能力强，并且更接近于成肌细胞的活体研究。

2 原代成肌细胞纯化方法

成肌细胞原代培养中会不可避免的混有成纤维细胞、血细胞等杂细胞，因此有效的纯化方法，以便得到较纯的成肌细胞是进行后续实验的关键。

2.1 差速贴壁

该方法是利用成纤维细胞先于成肌细胞贴壁的原理来分离细胞，当成纤维细胞已经贴壁而成肌细胞未贴壁或贴壁不多时，转出含有尚未贴壁的成肌细胞的细胞悬液于一新培养瓶，重复3次以上即可完成细胞纯化。在成肌细胞体外培养的研究中很多研究者都采用这一方法进行纯化。如 Wu等[6]、Kyle等[7]都采用该方法分别对山羊、小鼠骨骼肌进行纯化。另外，差速贴壁纯化法有别于其他细胞标记分选方法，对细胞生物活性等影响较小，适应于在体移植及临床应用；该方法原理相对简单，利于大规模培养或生产；但相比其他纯化方法，操作步骤相对较多，耗时相对较长，有待进一步改进。

2.2 梯度离心

该法是将Percoll液制成非连续密度的梯度液，根据细胞的沉降系数的不同，不同种类的细胞会沉降在不同的密度液面之间，然后根据目的细胞的沉降特点，选取对应液面即可抽出目的细胞。Percoll液密度梯度离心法的特点是一次性就能分选纯化出目的细胞，但是所需的细胞量大、操作步骤繁琐、易受污染等。

2.3 其他

随着成肌细胞特异性的标志物的逐渐认识，流式细胞分选、免疫磁珠分选等技术开始被用来分选成肌细胞。Bosnakovski等[8]通过 Pax7标记成肌细胞成功运用流式细胞分选方法将其分选出来。流式细胞分选和免疫磁珠分选的特点是可以短时间内纯化出高纯度的目的细胞，但是由于产量低，设备和条件的限制，较难普遍开展，并且所使用的抗体等试剂价格较高且有种属特异性，所以上述两种方法的应用受到限制。另外使用成纤维细胞抑制剂也被认为是一种纯化方法，但是抑制剂不可避免的会影响成肌细胞的生长活力，所以应用并不广泛。

3 影响成肌细胞增殖分化的因素

从组织工程学的角度考虑，成肌细胞作为种子最好是保持增殖状态避免分化为肌管，以便于体外获得更多且保留“干性”的种子细胞[9]，因此研究影响成肌细胞增殖分化的因素就显得极为重要。

正常成年骨骼肌中，成肌细胞处于静止状态，不进行有丝分裂，不进行DNA转录，处于细胞周期G0期，当成肌细胞受到外界刺激，如机械牵拉、损伤或者肌病时便被激活，进入G1期开始增殖。目前关于成肌细胞启动激活的作用机制还不完全清楚，但是有学者认为在成肌细胞激活过程中一氧化氮（NO）/肝细胞生长因子（HGF）/肝细胞生长因子受体（c-MET）信号通路起着重要作用[10]。

激活后的成肌细胞增殖和分化受多种因素的影响，其中包括MRF和多种生长因子。但目前对它们的具体作用机制仍处于探索研究阶段。

肌肉特异性的基础蛋白 MyoD、Myf5、肌细胞生成素（myogenin，Myog）和MRF4组成了MRF转录因子家族，它们在成肌过程中调控着基因的表达，对细胞周期调控起着重要的作用。已被证实，MyoD和Myf5直接激活参与细胞周期进程的基因，导致成肌细胞增殖；Myog通过激活下调细胞增殖相关基因表现出抗增殖活性，导致成肌细胞退出细胞周期并进行成肌分化；MRF4由于缺乏良好的细胞模型对其功能进行研究，所以它对于成肌作用的特点尚未揭示清楚[11]。

HGF可以作用于静息和激活成肌细胞的表面受体 c-Met，活化的HGF/c-Met通可以刺激静息的成肌细胞进入细胞周期、增加其增殖并抑制成肌分化[12]。bFGF参与细胞的生长、存活、迁移和胚胎发育。在活体骨骼肌以及体外培养分化的成肌细胞中都发现有bFGF[13]。IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ在调节成肌细胞活性方面扮演着重要角色。IGF-Ⅰ有多重功能，包括抗炎、细胞迁移以及促进成肌细胞增殖分化；IGF-Ⅱ被认为只有促进成肌分化的作用[14]。

近期研究表明[15]，低氧环境通过上调 Pax7以及下调MyoD和Myog利于成肌细胞维持静止状态，这一过程可能是通过激活Notch信号通路实现的；更为重要是的低氧环境能够增加移植效率并促进移植细胞的自我更新。

4 成肌细胞临床应用前景

近年来，随着医学发展的深入，细胞、基因治疗逐渐步入临床应用。有研究表明，成肌细胞移植后不仅可修复局部组织缺损，还能与宿主细胞融合共享正常基因产物，进而治疗宿主的基因缺陷[16]。体现了成肌细胞可应用于细胞治疗和基因治疗的两面性，进而被广泛关注。

4.1 成肌细胞在心脏疾病治疗的应用

成肌细胞用于心肌梗死后移植的想法起源于在20世纪90年代中期左右，基于几个临床相关的优势，成肌细胞成为第一个试图被用来治疗心衰的细胞[17]。这些优势包括：自体来源，高度增殖能力，成肌分化特性，抗缺血能力[18]。成肌细胞移植能增加心肌梗死动物模型的左心室功能[19]。尽管移植的成肌细胞仍然保留着增殖能力，但是几周后移植心脏上只检测很少的移植细胞。心内移植的成肌细胞存活率低原因可能是无效移植和它们在体内有限的再生能力导致的。使用自体成肌细胞移植已经证明通过减轻受损心脏的心脏重塑和心肌代谢来提高心功能[20]。当然，成肌细胞移植治疗心脏疾病所需要面对的问题还远不止这些，如合适的细胞移植数目、移植后可能出现心电紊乱进而导致心律失常等问题需要今后更多、更加深入的研究。

4.2 成肌细胞在肌损伤和肌病的应用

成肌细胞移植一直以来被认为是肌损伤和肌病的有效治疗方式，特别是进行性肌营养不良导致的肌萎缩，如杜氏综合征（DMD）。现已研究证实，成肌细胞能够在萎缩肌肉里形成肌萎缩蛋白（分布于骨骼肌和心肌细胞膜的质膜面，起细胞支架作用，维持肌纤维完整性和抗牵拉功能）阳性肌纤维，并且这种供体来源的肌萎缩蛋白的转录可以被观察到[21]，移植后肌纤维的强度得到明显提高[22]。目前限制成肌细胞移植治疗的障碍是移植细胞迅速死亡以及移植细胞迁移能力有限[23]，可以分别通过使用免疫抑制剂以及高密度接种使其得到一定的解决[24]。对于体外培养成肌细胞的再生能力以及自我更新能力受限的问题，目前部分研究关注提高成肌细胞培养条件[25]，已期望解决这一问题。

4.3 成肌细胞在泌尿系统疾病的应用

肌源性细胞移植已被用来治疗由于括约肌缺乏或者损伤导致的尿失禁。将成肌细胞移植到下尿路的尿道和膀胱壁上后，观察到这些部位的平滑肌层有肌管肌纤维形成[26]。高度纯化的肌源性细胞（包括有干细胞特性的克隆谱系细胞）不仅在注射点展现出成肌分化，而且也能分化成 平滑肌肌动蛋白阳性肌细胞；另外，实验研究表明在膀胱注射部位一些供体细胞移植来源的肌纤维可以接受神经支配并表达乙酰胆碱受体[27]。总体说来，压力性尿失禁患者的一期临床实验的初步研究结果是鼓舞人心的。12个月的跟踪随访显示85%的尿失禁病人得到了治愈[17]。

4.4 成肌细胞在骨科的应用

目前应用于骨组织修复的种子细胞研究主要集中在骨髓间充质干细胞（BMSCs），并已证实其良好的应用前景，但是其来源及取材限制等问题却不可忽略。骨骼肌源性干细胞（MDSCs）是一类具有多分化潜能和自我更新能力的多潜能干细胞。此外，这些干细胞丰富，易于获得和迅速扩增。研究人员用纯化的小鼠肌源性干细胞的克隆谱系证明了这种细胞移植能够促进骨愈合，并且表明这些细胞是良好的BMP4 （TFG-超家族成员之一，对骨形成起着重要作用）基因载体。同时携带BMP4和血管内皮生长因子（VEGF）的肌源性干细胞在骨形成时能够一起到协同作用，能同时促进骨和血管生成[28]。近期研究者从兔骨骼肌组织中分离培养出MDSCs，并成功诱导分化为成骨细胞，而且诱导分化后细胞外基质可见明显矿化，成骨基因mRNA表达明显升高[29]。

4.5 成肌细胞在神经系统疾病的应用

成肌细胞作为成体干细胞已被证实有多向分化潜能，向神经元和神经胶质细胞分化就是其中一种[30]。近年研究人员利用生长因子体外诱导成肌细胞分化，发现体外培养的成肌细胞在一定条件下可以向神经前体细胞分化。MitraLavasani等人从成人肌组织分离得到肌源性干细胞并将其移植到轴突生长锥周围，植入的肌源性干细胞浸润再生神经并向雪旺细胞分化，促进了损伤轴突再生，并且可以检测到功能恢复得到持续改善，而且术后18月没有观察到明显不良反应[31]。

5 展望

伴随细胞、分子生物学研究的发展与进步，对成肌细胞的研究展示出了诱人的应用前景。如何进一步深化对影响成肌细胞自我更新、增殖分化微环境等因素的认知，充分应用无血清培养、转基因等技术，使成肌细胞在组织工程、医用再生生物材料的研发与3D打印技术领域中得到应用，将会为临床精准医疗奠定基础，而（成肌）细胞培养体系的建立与完善是促进其临床转化不可或缺的。

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Primary culture of myoblast and its clinical application prospect

Qiu Yujia1,Wang Wei2,3.1 School of Graduate,Jinzhou Medical University;2 Department of Orthopedics Research In stitute,Jinzhou MedicalUniversity;3KeyLaboratory ofMedical Tissue Engineering,JinzhouLiaoning,121000,China

Myoblast,mononuclearquiescent cellsin muscle tissue,locatedbetweensarcolemmaandbasementmembrane, the precursor cell of muscle cell,plays an important role in the repair process of damaged muscle.With the development ofmolecular biologyandcellbiology,pecu-liaritiesof myoblastwere further discovered,suchaseasyaccessibility,wide source,strongabilityof proliferationanddifferentiationin vitro,fusionwith receptormusclecellsandsharegeneproducts, without unlimited proliferation and tumor formationafter implantation,autologous myoblast transplantation would not cause ethical controversy.Therefore myoblast is regarded as excellent seed cells to be used in the study and treatment of many kinds of system related diseases.This article provides a summary concentrate on the primary myoblast isolation, purification,factors affecting the proliferation and differentiation,and the prospects of the clinical application.

Myoblast;Primary culture;Cell therapy

Q813.1+1

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2017.02.018

swgk2016-09-00207

邱裕佳（1989-）男，硕士。研究方向：骨、脊髓与周围神经损伤修复重建。

*[通讯作者]王伟（1961-）男，博士，二级教授，博士生导师。研究方向：骨、脊髓与周围神经损伤修复重建、医学组织工程与再生医学。

2016-09-06)

辽宁省自然科学基金面上项目（201602322、2015020556）

锦州医科大学，1研究生院；2骨外科学研究所；3辽宁省医学组织工程重点实验室；辽宁锦州121000