枣花柱头荧光染色方法的优化*

任海燕，王永康，赵爱玲，薛晓芳，李 毅，李登科

（山西农业大学果树研究所，果树种质创制与利用山西省重点实验室，太谷 030815）

枣落花落果严重，坐果率低，一般自然坐果率仅1%左右[1]，且枣胚败育普遍存在[2]。许多学者针对这一现象，开展了枣柱头可授性、花粉萌发情况、授粉受精等开花生物学特性的研究，国内研究较多的使用联苯胺-过氧化氢法（MTT）测定柱头的可授性[3-6]，此方法虽快捷，但可授性强弱指标难以量化。相比而言，利用荧光显微法判断柱头可授性和花粉管生长较为直观准确[7-11]。枣花柱微木质化，花柱细胞组织较厚，在荧光显微观察时易出现花粉管生长过程被花柱组织遮挡的现象，因此在试验过程中，常采用适宜浓度的NaOH作为软化剂软化花柱，可以达到预期的效果。但若NaOH浓度使用不当，或出现花柱压片不成形，或花粉管结构不清晰等影响试验效果。为了提高枣花粉管生长特性等相关试验的效率，以期得到理想的试验图片，本研究以‘冷白玉’枣花为试材，对软化方法、染色pH环境进行了优化，以期为枣花粉管生长特性的研究提供实验方法依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料‘冷白玉’枣采自山西省农业科学院果树研究所国家枣资源圃，该品种盛花期为6月上旬，选取无病、长势良好的枣吊，定花定果，以黄蕾期（蜜盘刚出蜜）进行人工授粉，授粉品种为‘伏脆蜜’，花粉萌发率为94%。

1.2 试验方法

1.2.1材料

采集枣花，置于FAA（70%乙醇∶甲醛∶冰醋酸=90∶5∶5）固定液中固定备用。

1.2.2不同软化处理的优化

从FAA中取出枣花，蒸馏水清洗10次，分别置于不同的条件进行软化：于8 mol/L NaOH溶液中浸泡10 min；于2 mol/L NaOH溶液中浸泡并文火水煮30 min；于8 mol/L NaOH溶液中浸泡并在60 ℃恒温水浴中10 min。每处理重复3次，每次选取枣花30朵。

1.2.3不同pH值缓冲液处理的优化

枣花经过2 mol/L NaOH溶液浸泡并文火水煮30 min软化后，经不同pH值梯度缓冲液（1 mol/L NaOH与45%冰醋酸配制而成），pH值分别为3.0、5.0、7.0、9.0，浸泡50 min。每处理重复3次，每次选取枣花30朵。

1.2.4不同染色剂处理的优化

枣花经过2 mol/L NaOH溶液浸泡并文火水煮30 min软化后清洗2～3次，经缓冲液pH值为7.0浸泡50 min清洗后，置于不同的染色剂：0.1%水溶性苯胺蓝，染色30 min；0.1 g水溶性苯胺蓝+0.7 g K3PO4，蒸馏水定容至100 mL，加45%冰乙酸调至pH值为8.0，染色5 min。每处理重复3次，每次选取枣花30朵。

枣花染色后，蒸馏水清洗4～5次后，用刀片和镊子取出雌蕊，放置在载玻片上，轻盖盖玻片，制片后在倒置荧光显微镜（Olympus DP71）下观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 不同NaOH溶液处理对枣花雌蕊软化效果的影响

如图版2所示，枣花在8 mol/L NaOH溶液中浸泡10 min，花柱表面的花粉粒不清晰，花柱成形（图版2-A-a）；枣花在2 mol/L NaOH溶液中浸泡并水煮30 min后，花粉管形态清晰可见，且花柱结构基本保持完整（图版2-A-b）；在8 mol/L NaOH溶液中浸泡并在60 ℃恒温水浴中10 min，花柱表面的花粉粒可以看到，但花柱不成形、破裂，花粉管暴露，不能观察到完整的花柱结构（图版2-A-c）。通过比较，枣花在2 mol/L NaOH溶液中浸泡并水煮30 min，软化效果好，花柱结构保持完整且花粉管清晰可见。

2.2 不同pH值缓冲液处理对花粉管染色效果的影响

当缓冲液pH值为3.0时，花柱细胞呈蓝色，花粉管染色与其他部分对比不明显（图版2-B-a）；当pH值为5.0时，花柱细胞部分呈蓝色，可观察到少量的花粉（图版2-B-b）；当pH值为7.0时，可清晰可见花粉管在花柱道中的伸长情况，花柱呈透明状，拍摄效果最佳（图版2-B-c）；当pH值为9.0时，花柱细胞呈黑色，可观察到部分花粉粒，花柱与背景对比差，无法观察到花粉管的伸长情况（图版2-B-d）。由此可见，当缓冲液pH值为7.0时，观察花粉萌发及花粉管伸长情况，效果最佳。

2.3 不同染色剂处理对枣花粉管染色效果的影响

枣花经缓冲液浸泡，蒸馏水清洗后在0.1%水溶性苯胺蓝条件下，染液呈酸性，亮蓝色，滴于白纸上有蓝色染晕，染色30 min，观察可见花柱表面花粉粒情况及花粉在柱头萌发情况，但在花柱道中只可观察到部分花粉管萌发，染色不明显（图版2-C-a）；在加有K3PO4的苯胺蓝染液，pH值为8.0的条件下，染液呈暗蓝色、清亮，滴于白纸上无染晕，染色5 min，染色效果好，可清晰观察到花粉管萌发情况，花粉管结构明显（图版2-C-b）。研究结果表明，在加有0.7 g K3PO4的0.1%水溶性苯胺蓝溶液中花粉管清晰可见，染色效果好。

3 结论与讨论

NaOH溶液的强碱性能可以很好地降解纤维素、半纤维素、木质素等成分[12-14]，从而达到软化材料的效果。许多研究者利用NaOH软化这一原理观察花粉管生长特性，但不同树种所使用的NaOH浓度不同[15-17]。在枣方面，也有不少研究。王尧等[7]、张学英等[8]、李登科等[10]研究枣花粉萌发情况和授粉受精过程均使用8 mol/L NaOH进行解离软化花柱。邵凤侠等[9]在对‘中秋酥脆枣’柱头形态发育进程与可授性研究中，使用的软化剂为10 mol/L NaOH软化10 h。本试验改变了以往使用NaOH浸泡的方式，而是使用2 mol/L NaOH，并进行水煮的方式，使花柱组织得到了最大程度的透明化处理，这一结果在侯思皓等[11]研究枣花粉生长特性中也同样得到了证实。

本试验比较了3种软化枣花的方法，认为经FAA固定的枣花，蒸馏水清洗5～6次后，浸泡在2 mol/L NaOH溶液中，文火水煮30 min，取出枣花蒸馏水清洗5～6次，在pH值为7.0的缓冲液中浸泡50 min，取出枣花清洗5～6次，然后进行染色的方法，无需将枣花从FAA中取出进行酒精梯度复水，简化了软化步骤，避免了枣花柱结构的破裂，使花柱组织得到了最大程度的透明化处理，花粉管观察效果更佳，大大地提高了实验效率。

苯胺蓝压片观察花粉萌发在很多植物上应用广泛，该方法简便、快捷、直观，其原理是苯胺蓝在碱性条件下与花粉管壁中的胼胝质发生反应，在紫外光下发出黄绿色荧光[17]。苯胺蓝染液在过酸或过碱环境中，染色效果均差。本研究结果证实了苯胺蓝染液在pH值为8.0，染液呈暗蓝色、清亮，滴于白纸上无染晕。枣花无需在苯胺蓝染液中过夜染色，只需在pH值为8.0的苯胺蓝染液染色5 min，即可制片后观察，花粉管清晰，且与花柱细胞对比明显，染色效果最佳。可见，相比传统方法，图片效果明显改善，染液pH值的确定可提高实验的效率和准确性。

传统方法联苯胺-过氧化氢法是将柱头浸于苯胺蓝-过氧化氢反应液中，通过观察柱头周围是否呈现蓝色并有大量气泡来判断柱头是否具有可授性。首先，这种方法需通过观察柱头染色颜色的深浅来判断柱头可授性的强弱，观察结果无法标准量化。其次，此方法反应时间不一致，一般对于可授性弱的枣柱头，反应时间需10～15 min；而对于可授性强的柱头，反应时间也需3～5 min，才能观察到结果[4-5]。相比而言，通过荧光显微镜能够直观地观察到花粉管生长的真实情况，能够清晰、准确地反映出授粉后各部分的动态变化[18]。本文介绍的方法进一步优化了枣柱头荧光染色方法，主要体现在以下几方面。①简化了处理过程：将枣花从FAA液中取出后无需进行酒精梯度复水。②花柱结构保持完整，花粉管更为清晰：软化处理只需浸泡在2 mol/L NaOH的溶液中，文火水煮30 min即可，无需在NaOH溶液中浸泡数小时，避免了较厚的枣花柱组织遮挡花粉管的现象。③节省了时间，更加高效：枣花在pH值为8.0的苯胺蓝染液染色5 min即可制片后观察，无需在苯胺蓝染液中过夜染色，节省了时间。此外，染液pH值的确定大大地提高了实验的效率和准确性。