蓝猪耳花粉管在雌蕊生长途径中钙的分布特征

陈素红， 邹 璞， 廖景平

(1. 广东食品药品职业学院， 广州 510520； 2. 中国科学院 华南植物园， 广州 510650)

花粉离体萌发和花粉管生长实验早已证实了钙在其中起重要作用。然而，花粉管的离体生长系统可以模拟但不能完全代替花粉管的体内生长状况。要证实体内花粉管生长与钙的关系，还需要对花粉管在体内雌蕊组织中的生长途径加以研究。

目前，国内多位研究者[1-6]采用焦锑酸盐沉淀法研究了多种植物的花粉管生长轨道(柱头表面、花柱引导组织、子房壁内表面、珠孔)，发现雌蕊组织均有丰富的钙沉淀颗粒，且在这些组织中的钙沉淀颗粒多分布在引导组织细胞壁和胞外基质的质外体系统中，证明在离体实验中花粉管生长需要钙的特征在体内可以从富含钙的引导组织中得以满足。离体实验中还发现花粉管有向高钙浓度方向生长的向化性特征，并在金鱼草[7]的雌蕊中也确实发现钙有明显的梯度分布，推测雌蕊中的钙梯度分布是吸引花粉管定向生长的原因。但除了少数几种植物如烟草[5]、金鱼草[7]、莴苣[8]和猕猴桃[9]的雌蕊中存在钙梯度分布，在向日葵[1]、陆地棉[2]、水稻[3]、刺槐[10]等其他许多植物的雌蕊中并没有发现明显的钙梯度。这可能与植物种类、研究方法等有关，需进行更为广泛的观察。

钙在体内生长的花粉管中的分布特征也是研究受精前花粉管生长与钙关系的重要方面。Jaffe等用示踪元素45Ca作为外源钙发现，进入花粉管中的45Ca最初集中在花粉管顶端区域[11]。Reiss等用proton-induce x-ray emission (PIXE) 技术测量麝香百合花粉管中的总钙分布，结果显示花粉管顶端区域的钙浓度高，而基部的相对较低，呈现梯度分布[12]。多位研究者[13-16]用金霉素处理后观察花粉管中的细胞器膜钙时发现花粉管顶端区域含较高的膜钙，而基部区域的膜钙较低，也呈现出梯度分布。随着研究技术的改进，有关花粉管中游离钙的梯度分布研究显示，钙梯度的明显区域在花粉管顶端20 μm以内，20 μm以后的钙梯度变化幅度较小[17-21]。然而，对花柱中生长的花粉管的钙分布研究非常少，只在向日葵[1]、陆地棉[2]和烟草[22]中，研究者应用焦锑酸盐沉淀法观察到体内生长的花粉管尖端的细胞器区段的胞质、细胞器及管尖外周钙含量较高，并且也仅在烟草研究中根据授粉和未授粉的花柱在开花后1 d引导组织胞外基质在靠近子房的部位有密集的钙沉淀颗粒，推测花柱中存在钙离子浓度梯度。本文采用焦锑酸钾沉淀法对蓝猪耳体内生长的花粉管以及柱头和花柱中的钙分布进行定位，以期揭示钙对蓝猪耳体内花粉管生长的作用机制。

1 材料和方法

试验材料蓝猪耳(Toreniafournieri)种植在中科院华南植物园温室，每年4—12月开花，盛花期6—10月。蓝猪耳花柱长1.5 cm，通常花粉在柱头上萌发需要1 h，花粉管在体内生长7 h到达子房顶部。将花柱0.3、0.9和1.5 cm处人为分为3个时期(从柱头端开始量取)，授粉后1 h取柱头，2、4及6 h取上述3个时期的花柱，7 h取子房顶部。每次取柱头、3个时期的花柱以及子房顶部进行相对应比较(图1)。取去雄未授粉的柱头、0.3、0.9、1.3和1.5 cm 处(从柱头端开始量取)的花柱进行对比观察。切取柱头和约1 mm 长的花柱，子房顶部，将其迅速放入含2%戊二醛、1%焦锑酸钾、0.1 mol/L磷酸缓冲液配制的前固定液(pH 7.8)中，4℃下固定12～24 h。用1%焦锑酸钾、0.1 mol/L磷酸缓冲液配制的洗涤液(pH 7.8)洗涤3次，每次30 min，之后转入1%锇酸、1%焦锑酸钾、0.1 mol/L磷酸缓冲液配制的后固定液(pH 7.8)中，在 4℃下固定16 h。再用上述洗涤液冲洗，经乙醇梯度(30%、50%、70%、80%、90%和100%)脱水，环氧丙烷置换，Epon 812环氧树脂渗透并包埋。每个处理切5个样品。用LK-S型超薄切片机切片80 nm厚的柱头和花柱切片用醋酸双氧铀染色20 min，清洗并晾干后用日本JEM-1010透射电子显微镜100 kV观察、拍照。

图1 蓝猪耳雌蕊以及划分花柱时期

2 结果与分析

蓝猪耳柱头属湿型，由两裂片构成。裂片相对的内表面为花粉接受面，外表面为非接受面。在接受面上的柱头细胞为乳突细胞，紧接乳突细胞之下是引导组织。蓝猪耳花柱属开放型，花柱道两端较宽、中间较窄，其中充满分泌物。花柱通道有一层特化的内表皮细胞，即通道细胞(或称引导组织细胞)。

2.1 花粉萌发以及花粉管在花柱内生长过程中钙的分布特征

蓝猪耳在开花当天，柱头两裂片紧闭，开花后2 d，两裂片敞开，开始自然接受花粉。开花前去雄，开花后2 d进行人工授粉。授粉1 h，花粉在柱头上水合并萌发。刚萌发出的花粉管壁上沉淀较多的钙沉淀颗粒，花粉管内容物中很少有钙沉淀颗粒分布(图版Ⅰ-1)。此时花粉萌发的外环境中钙分布较少。授粉2 h，花粉管沿着引导组织细胞生长至0.3 cm花柱处。此时与花粉管相邻的通道细胞细胞壁上及胞外基质中分布较多的钙沉淀颗粒，而花粉管尖端细胞器区段的钙沉淀颗粒不多，集中分布在花粉管壁上，且钙沉淀颗粒较大(图版Ⅰ-3)；而管中内容物的钙沉淀颗粒很少，仅在管内细胞器上有少量钙沉淀颗粒(图版Ⅰ-6)。授粉4 h，花粉管生长至0.9 cm花柱处。此时花粉管中的钙沉淀颗粒有所增加，并且在花粉管生长的胞外基质中也均匀分布较多的钙沉淀颗粒(图版Ⅰ-4)。花粉管中大量的钙沉淀颗粒聚集在管壁上，并且几乎连成线状；在管内的液泡中也有较大的钙沉淀颗粒(图版Ⅰ-7)。授粉6 h，花粉管生长至1.5 cm花柱(花柱基部)处。此时花粉管中分布大量的钙沉淀颗粒，而其周围的胞外基质中钙分布相对少一些(图版Ⅰ-5)。大量的钙沉淀颗粒不仅分布在花粉管壁上，而且在管内细胞器以及其他内容物中也有大量钙分布(图版Ⅰ-8)。授粉7 h，花粉管已从花柱生长至子房顶部子房室中。此时花粉管顶端的钙主要分布在管壁上，管内几乎没有钙分布；然而在花粉管生长的外环境子房室中有大量的钙沉淀颗粒，并且大量的细小钙沉淀颗粒包围着花粉管顶端(图版Ⅰ-2)。蓝猪耳花粉管在花柱中生长期间的钙含量随着生长存在着逐渐递增的过程，花粉管到达花柱基部时，钙沉淀颗粒达到最多。待花粉管进入子房室，室内环境中钙含量远大于花粉管中的(图版Ⅰ-2)。蓝猪耳花粉萌发及花粉管在花柱内生长过程中的钙分布情况见表1。

图版I 花粉萌发及花粉管在花柱内生长过程中钙的分布特征

Plate I Calcium distribution ofToreniafournieripollen tubes during pollen germination and pollen tube growth in style

1：授粉1 h，花粉刚萌发出花粉管，Bar=500 nm；2：授粉7 h，花粉管进入子房顶部，Bar=1 μm；3：授粉2 h的花粉管，Bar=2 μm；4：授粉4 h的花粉管，Bar=2 μm；5：授粉6 h的花粉管，Bar=2 μm；6：授粉2 h的花粉管，Bar=500 nm；7：授粉4 h的花粉管，Bar=500 nm；8：授粉6 h的花粉管，Bar=500 nm

2.2 花粉管在各发育阶段的不同细胞学区域中钙的分布特征

花粉管是顶端生长，通过细胞壁物质成分向顶端的分泌增加花粉管的长度。花粉管的结构可依次区分出不同的细胞学的区域：顶端区、亚顶端区、核区、液泡化区和胼胝质塞区。蓝猪耳的花粉管在各个发育阶段的不同区域中的钙分布存在差异。生长2 h的花粉管中，亚顶端区域前段的花粉管壁上钙沉淀颗粒不多，但钙沉淀颗粒细小(图版Ⅱ-9)，而在管内细胞器上有较多的钙沉淀颗粒，且钙沉淀颗粒较大(图版Ⅱ-10)；亚顶端区域中段的花粉管壁上钙沉淀颗粒较多，且钙沉淀颗粒较大，同时在管内物质中也分布较多的钙沉淀颗粒(图版Ⅱ-11)；亚顶端区域末段的花粉管中出现小液泡，此段花粉管壁以及内容物中有少量的钙沉淀颗粒(图版Ⅱ-12)。生长4 h的花粉管中，亚顶端区的花粉管壁上有大量的钙沉淀颗粒，几乎连成粗线状，而花粉管内细胞器以及内容物中钙沉淀颗粒很少(图版Ⅱ-13)；核区的花粉管壁以及细胞器上聚集较多的大颗粒的钙沉淀(图版Ⅱ-14)，而管内细胞核及其中央的内容物中钙沉淀颗粒相当少，几乎没有(图版Ⅱ-15)；液泡化区的花粉管中钙沉淀颗粒很少，只在电子密度大的内容物中有分布，花粉管壁以及液泡中几乎没有钙分布(图版Ⅱ-16)。生长7 h的花粉管中，顶端区的花粉管壁上聚集大量的细小钙沉淀颗粒，而管内钙沉淀颗粒很少(图版Ⅱ-17)；亚顶端区的花粉管中钙沉淀颗粒很少，而在管外基质中分布较多的钙沉淀颗粒(图版Ⅱ-18)；核区的花粉管中几乎没有钙沉淀颗粒，仅在管壁上有少量的钙沉淀颗粒，但在管外基质中分布着较多的细小钙沉淀颗粒(图版Ⅱ-19)。蓝猪耳同一发育阶段的花粉管中钙呈现出梯度分布；随着花粉管的不断生长，顶端区域的钙不断增加，钙梯度分布更明显。

表1 蓝猪耳花粉管在花柱内生长过程中的钙分布变化

“-” 表示没有钙沉淀颗粒； “+” 表示有少量钙沉淀颗粒； “++”表示有一些钙沉淀颗粒； “+++”表示有较多钙沉淀颗粒；“++++”表示有大量钙沉淀颗粒

2.3 未授粉柱头以及花柱的钙分布特征

为探索柱头和花柱组织中的钙分布特征与花粉萌发和花粉管生长之间的关系，对只去雄未授粉的柱头和花柱组织进行观察。取蓝猪耳开花后2 d(花去雄3 d)的柱头和花柱进行观察。柱头接受面的乳突细胞已形成了大液泡，在细胞壁，细胞质以及液泡膜上钙沉淀颗粒相当少(图版Ⅲ-20)。未授粉花柱0.3 cm处的通道细胞形状规则，其细胞壁和大液泡中几乎没有钙沉淀颗粒，而在胞外基质中有一些细小的钙沉淀颗粒(图版Ⅲ-21)。在花柱0.9 cm处，通道细胞形状不规则，细胞壁和大液泡中钙沉淀颗粒仍然很少，而在花柱道内分泌物中有较多的钙沉淀颗粒(图版Ⅲ-22)。在花柱1.3 cm处，通道细胞变得更加不规则，并且胞外基质以及花柱道中的分泌物很多，在胞外基质和分泌物中有大量的钙沉淀颗粒(图版Ⅲ-23)。在花柱1.5 cm处，通道细胞变得规则，且在细胞中有淀粉粒出现，此时胞外基质中均匀分布着大量的钙沉淀颗粒，而通道细胞中仍然很少钙沉淀颗粒(图版Ⅲ-24)；然而在此处花柱组织的微管束细胞中也很少有钙沉淀颗粒，只是在胞内液泡膜上有零星的钙沉淀颗粒(图版Ⅲ-25)。蓝猪耳未授粉花柱由上至下钙沉淀颗粒呈递增的梯度分布。蓝猪耳未授粉柱头及花柱的钙分布情况见表2。

图版II花粉管在各发育阶段的不同细胞学区域中钙的分布特征Plate II Distribution of calcium in different cytological regions of Torenia fournieri pollen tubes at different development stages

9～12：生长2 h的花粉管；9为亚顶端区域前段，Bar=500 nm；10为亚顶端区域前段花粉管内细胞器，Bar=500 nm； 11为亚顶端区域中段，Bar=200 nm；12为亚顶端区域末段，Bar=200 nm。13～16：生长4 h的花粉管；13为亚顶端区，Bar=500 nm；14为核区，Bar=200 nm；15为核区中两精细胞核(SN)及营养核(VN)，Bar=200 nm；16为液泡化区，Bar=200 nm。17～19：生长7 h的花粉管；17为顶端区，Bar=1 μm；18为亚顶端区，Bar=1 μm；19为核区，Bar=1 μm

3 讨论与结论

钙不仅影响蓝猪耳花粉萌发，也对花粉管生长起着非常重要的调节作用[23]。蓝猪耳花粉在柱头上萌发时，柱头细胞的钙沉淀颗粒很少，花粉管壁上钙沉淀颗粒较多；花粉管刚进入花柱时，相邻的花柱通道细胞和胞间基质中钙沉淀颗粒较多，而管壁上的钙沉淀颗粒相对减少，管内的钙沉淀颗粒相对增多；花粉管伸长至花柱基部时，相邻花柱组织的钙沉淀颗粒相应减少，而管壁上的钙沉淀颗粒先增多后减少，管内的钙沉淀颗粒逐渐增多；当花粉管进入子房，子房室内有大量的钙沉淀颗粒，花粉管壁上钙沉淀颗粒又有增多，而这时管内的钙沉淀颗粒相对较少。由此推测：花粉萌发时，蓝猪耳的花粉中有足够的钙满足花粉萌发；花粉管生长中，钙不断从花柱组织细胞中进入花粉管，满足花粉管内雄性生殖细胞的分裂和花粉管的生长；花粉管进入到子房，花粉管内无需太多的钙，而管外高钙环境有助于花粉管进入珠孔。

图版III 未授粉柱头以及花柱钙的分布特征Plate III Calcium distribution of stigma and style in unfertilized Torenia fournieri

20：柱头的乳突细胞，Bar=10 μm。21：0.3 cm花柱处的引导组织(TT)和花柱道(SC)，Bar=10 μm。22：0.9 cm花柱处的引导组织和花柱道，Bar=10 μm。23：1.3 cm花柱处的引导组织和花柱道，Bar=2 μm。24：1.5 cm花柱处的引导组织和花柱道，Bar=2 μm。25：1.5 cm花柱处的微管束(VB)，Bar=10 μm

表2 蓝猪耳未授粉柱头及花柱的钙分布变化

“+” 表示有少量钙沉淀颗粒； “++”表示有一些钙沉淀颗粒； “+++”表示有较多钙沉淀颗粒；“++++”表示有大量钙沉淀颗粒

已经有多位研究者对花粉管中的总钙、膜钙和游离钙分布进行研究，发现花粉管中的钙呈梯度分布，并且发现花粉管中的钙梯度分布现象仅在生长中的花粉管内存在[12-21]。在培养基中加入或直接向花粉管内注射钙抑制剂后，花粉管中的钙梯度消失，花粉管停止生长；去掉钙抑制剂后，花粉管中的钙梯度重新建立，花粉管恢复生长[24-30]。花粉管中的钙梯度分布与花粉管的生长密切相关。蓝猪耳体内生长的花粉管中钙也呈梯度分布，并且随着花粉管不断生长，钙的梯度分布更加明显。

对雌蕊花粉管生长轨道的钙分布研究结果表明，凡是在花粉管生长所必经的部位中均有较相邻组织更为丰富的钙，而且这些组织的钙主要分布在质外体系统——细胞壁和胞外基质[8]。然而，雌蕊花粉管轨道中钙的梯度分布与花粉管定向生长的关系仍无定论。到目前为止，也只在烟草[5]、金鱼草[7]、莴苣[8]和猕猴桃[9]中发现花粉管轨道的钙呈梯度分布，而在向日葵[1]、陆地棉[2]、水稻[3]、刺槐[10]等植物不同切段的花柱中，并未观察到钙的梯度分布。不同植物花柱中钙梯度分布现象存在差异。这种差异的产生可能有以下几个原因：一是有些植物花柱中的钙分布差异很小，现有的技术难以检测出这种钙分布梯度；二是不同植物花柱中是否存在钙梯度分布特征可能与植物的种类有关。短花柱的植物花粉管可能无需花柱钙梯度分布定向吸引即可到达胚囊，而一些长花柱的植物花粉管到达胚囊需要很长时间，可能需要有某种机制保证花粉管的定向生长。本实验中，蓝猪耳的花柱属中等长度，在未授粉时已出现花柱中有明显的钙梯度分布特征，并且在授粉后，花粉管生长到达的部位均有较为丰富的钙。从而推测蓝猪耳花柱的钙梯度分布对其中生长的花粉管可能也具有引导作用。