红茶菌发酵山药枸杞果醋的工艺研究

张文莉，姚稳，巫永华，秦杰，苗敬芝*

(1.徐州工程学院 食品(生物)工程学院，江苏 徐州 221018；2.徐州工程学院江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏 徐州 221018)

红茶菌，俗称“海宝”、“胃宝”，是一种起源于中国东北的传统民间发酵型饮料。它是由醋酸菌、酵母菌和乳酸菌以茶糖水为原料混合发酵而成[1]。其母液中含有多种发酵微生物及其代谢产物，如茶多酚、茶黄素、多糖、氨基酸、D-葡萄糖二酸-1,4-内酯、维生素等，具有促进新陈代谢、保肝护肝、增强机体免疫力和抗氧化等功效[2-3]。近年来，研究者以红茶菌为对象研究开发了一系列产品并对其进行活性成分分析。文献[4]以红茶菌发酵液为基质，添加其他3种水果原汁一起发酵，得到水果红茶菌饮料并分析其生物活性和抗氧化性。徐清萍等[5]以谷物为原料，用红茶菌发酵制醋，并测定其理化指标。孙永康等[6]用红茶菌和酿酒酵母发酵茶糖水，制备新型发酵型茶酒。

山药，薯蓣科薯蓣属，缠绕草质藤本植物。《神农本草经》中记载，山药味甘、性平，入脾、胃、肾经，具有健脾补肺、补肾益精等功效。研究表明，山药中含有多糖、蛋白质、皂苷等成分，具有抗氧化、降血糖、降血脂和提高免疫力的作用[7-8]。枸杞，茄科枸杞属植物。枸杞中含有多种化学成分，如多糖、类胡萝卜素、生物碱和黄酮类等。现代药理研究发现枸杞具有清肝明目、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等功效[9]。

果醋是以一种或多种水果、果渣为原料，经现代生物技术酿造而成的饮料，其中含有多种有机酸，营养价值丰富，具有维持人体酸碱平衡，促进血液循环，抗菌消炎等功效[10]。本试验以山药和枸杞为原料，用红茶菌混合发酵制备复合型果醋，既延长了原料在室温下的保存时间，又改善了原料的感官特性，同时增加了其营养价值和保健功能。此外，采用Box-Benhnken响应面法对发酵工艺进行了优化，这也为山药枸杞复合型果醋的工业化生产提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红茶菌混合菌种：安徽九州神龙生物科技有限公司；山药、枸杞、红茶、白糖：均购于大润发超市。

α-淀粉酶(≥4000 U)、糖化酶(≥100000 U)：均购于上海源叶生物科技有限公司；酚酞、乙醇、氢氧化钠等：均为分析纯。

1.2 仪器与设备

YXQ-50A型立式压力蒸汽灭菌锅、LH-CNT65数显糖度计、PHSJ-4A型pH计、L550 型离心机、DHP-9082型电热恒温培养箱、HH-4型数显恒温水浴锅、JP728型榨汁机。

1.3 试验方法

1.3.1 红茶菌液的制备

称取5.0 g红茶加入500 mL沸水中，于85～90 ℃保持10 min，过滤得红茶汁，然后加入白砂糖100 g，混匀得茶糖水，冷却至室温。向茶糖水中加入40%的红茶菌母液，存放于灭菌的玻璃容器中，用双层纱布封口，然后放置在30 ℃恒温培养箱中静置发酵7 d，待液面产生薄膜即可得到红茶菌菌液[11]。

1.3.2 工艺流程

1.3.3 操作要点

1.3.3.1 枸杞汁的制备

挑选肉厚、无腐烂、无霉变褐变的宁夏枸杞。用流动水多次冲洗枸杞表面的灰尘或污物。清洗后的枸杞在40～50 ℃水中浸泡30 min。浸泡好的枸杞放入榨汁机中，按照1∶5 (g/mL)的比例加水，进行破碎打浆。将枸杞浆料压榨使渣滓分离得滤液，渣料加2倍水于水浴锅中浸提2次，滤液同浸提液混合得枸杞汁。

1.3.3.2 山药汁的制备

挑选新鲜无虫害、无霉烂、无机械损伤的淮山药，用流动水冲洗干净，刮刀去表皮，切成10～15 cm的山药段，立即放入90～95 ℃的热水中，热烫5 min，钝化酶的活性。山药段捞出放凉，切成2～3 mm的山药片。将山药片按照1∶3 (g/mL)的比例加水，再添加0.05%的异抗坏血酸钠进行护色处理30 min。护色后的山药经清水漂洗后，放入榨汁机中，按照1∶5 (g/mL)的比例加水，制备山药浆。将山药浆置于90～95 ℃的水浴锅中糊化30 min，冷却至55 ℃时加入0.05 mg/g的α-淀粉酶进行恒温酶解3 h，然后采用1%的柠檬酸将山药浆液的pH调至5.0，加入0.1 mg/g的糖化酶进行55 ℃恒温酶解2 h，最后将山药浆液加热至95 ℃保持10 min，进行灭酶处理，过滤到山药汁[12]。

1.3.3.3 调配混匀

将制备好的山药汁、枸杞汁按照体积比5∶3进行混合，用1%的柠檬酸钠将混合液的pH调至4.5，并调节其至适宜的初始糖度。

1.3.3.4 高温灭菌

调配混匀后的山药枸杞混合液在高压蒸汽灭菌锅中121 ℃灭菌15 min，冷却备用。

1.3.3.5 红茶菌的接种与发酵

将冷却后的山药枸杞混合液接入活化后的红茶菌中，放入恒温培养箱中发酵5 d，若时间再延长，会产生其他代谢产物，使果醋口味发生不良变化。

1.3.3.6 澄清

用1%壳聚糖对山药枸杞果醋进行澄清。用量为果醋总量0.5%，静置1.5 h。

1.3.3.7 杀菌

将制备好的山药枸杞果醋放于合适的包装瓶中，封好后进行巴氏杀菌。

1.3.4 山药枸杞汁最佳配比的确定

依次将山药汁与枸杞汁按照7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7的配比混合均匀，结合上述工艺流程及操作要点，调整山药枸杞的初始糖度为18%，红茶菌接种量为16%，发酵温度为30 ℃，在恒温培养箱中静置发酵5 d，制得山药枸杞复合果醋，利用感官评价指标确定山药枸杞汁的最佳配比。

1.3.5 果醋发酵工艺优化单因素试验

取上述处理好的山药枸杞汁(以其总量计)，在红茶菌接种量为12%、16%、20%、24%、28%，初始糖度为14%、16%、18%、20%、22%，发酵温度为22，26，30，34，38 ℃的条件下发酵5 d进行单因素试验，研究这3个因素对果醋发酵产酸量的影响。

1.3.6 果醋发酵工艺优化响应面试验

在单因素试验的基础上，选取红茶菌接种量、初始糖度、发酵温度为考察因素，总酸含量为响应值，运用Box-Benhnken试验设计对山药枸杞果醋发酵工艺进行优化，各因素水平见表1。

表1 响应面试验因素及水平Table 1 The factors and levels of response surface test

1.3.7 分析检测方法

1.3.7.1 感官评价

取山药枸杞果醋2 mL于25 mL具塞比色管中，加水至刻度，振摇，观察色泽。取山药枸杞果醋30 mL于50 mL烧杯中观察状态。用玻璃棒搅拌，品尝滋味，闻其气味。参照GB/T 18187—2000《酿造食醋》中的感官指标要求，从色泽、滋味和气味、状态3个方面对果醋进行感官评价。

1.3.7.2 理化指标的测定

总酸含量测定：参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》中的酸碱滴定法，以醋酸(g/dL)计。

可溶性固形物含量测定：参照NY/T 2637—2014《水果和蔬菜可溶性固形物含量的测定 折射仪法》。

1.3.7.3 微生物指标的测定

菌落总数及大肠菌群测定：参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》。

1.3.8 数据处理

使用Excel 2010 软件对数据进行统计分析并绘制图表，用Design Expert 11进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 山药枸杞汁最佳配比

由不同配料比混匀的山药枸杞汁在一定的初始糖度和温度下，由红茶菌发酵而成的果醋的感官评价，见表2。

表2 山药-枸杞最佳配比的感官评价Table 2 The sensory evaluation of the optimal ratio of Chinese yam to Lycium barbarum

由表2可知，当山药汁与枸杞汁的配比为4∶6时，色泽、滋味和气味及状态最符合感官要求。因此，选用山药汁与枸杞汁的配比为4∶6。

2.2 山药枸杞果醋发酵工艺优化单因素试验

2.2.1 红茶菌接种量对果醋总酸含量的影响

在初始糖度18%、发酵温度30 ℃的条件下，研究不同红茶菌接种量对山药枸杞果醋发酵产酸的影响，结果见图1。

图1 红茶菌接种量对果醋总酸含量的影响Fig.1 Effect of Kombucha inoculation amount on the total acid content of fruit vinegar

由图1可知，随着红茶菌接种量的增大，果醋总酸含量呈现先增长后缓慢下降的趋势。这是由于随着接种量不断增加，菌体会出现大量增殖，一方面会生成大量的代谢产物，导致细胞过早老化、自溶等现象，另一方面，菌体大量繁殖所需营养物质含量减少，从而导致果醋总酸含量下降[13]。因此，选择合适的红茶菌接种量有利于控制菌种密度和总酸含量，最佳接种量为16%。

2.2.2 初始糖度对果醋总酸含量的影响

在红茶菌接种量16%、发酵温度30 ℃的条件下，研究不同初始糖度对山药枸杞果醋发酵产酸的影响，结果见图2。

图2 初始糖度对果醋总酸含量的影响Fig.2 Effect of initial sugar content on the total acid content of fruit vinegar

由图2可知，随着初始糖度的增加，果醋总酸含量先增大后减小。这是由于足够的碳源可以使得菌体生长代谢产生丰富的有机酸和其他有益成分，但初始糖度过大，即混合液的渗透压过大，会导致菌体细胞脱水引起质壁分离，从而不利于其生长与发酵[14-15]。因此，要选择合适的初始糖度，太高或太低都不利于其发酵，最佳初始糖度为18%。

2.2.3 发酵温度对果醋总酸含量的影响

在红茶菌接种量16%、初始糖度18%的条件下，研究不同发酵温度对山药枸杞果醋发酵产酸的影响，结果见图3。

图3 发酵温度对果醋总酸含量的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on the total acid content of fruit vinegar

由图3可知，随着温度的上升，果醋总酸含量先上升后下降。温度是影响微生物生长与发酵的重要因素。当温度升高时，微生物细胞内的酶活性提高，反应加快，产酸较高；但温度过高时，细胞内酶失活，不利于微生物生长，从而产酸较少。因此，红茶菌发酵的最佳温度为30 ℃。

2.3 响应面试验

2.3.1 响应面试验结果及因素交互

根据单因素试验结果及表1中试验因素水平编码设计进行Box-Benhnken试验设计，结果见表3，回归模型方差分析见表4。

表3 Box-Benhnken试验设计与结果Table 3 Box-Benhnken test design and results

运用软件Design-Expert 11对表3中试验结果进行多元二次回归拟合，得到总酸含量(Y)与红茶菌接种量(A)、初始糖度(B)、发酵温度(C)的回归方程：Y=4.62+0.2738A+0.0863B+0.1100C-0.0725AB-0.0600AC+0.1050BC-0.4773A2-0.2523B2-0.7297C2。

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis for regression model

由表4可知，该模型影响极显著(P<0.0001)，回归方程相关系数R2=0.9863，决定系数(调整相关系数)RAdj2=0.9688，能在96.88%的变化范围内解释响应值的变化，且失拟项不显著(P=0.2535>0.05)，说明该模型拟合程度好，误差不大，适用于山药枸杞果醋发酵工艺的优化。

此外，在所选取的各因素水平范围内，A、A2、B2、C2所对应的P值均小于0.01，说明这几个因素对结果有极显著影响；B，C所对应的P值均小于0.05，说明这两个因素对结果有显著影响；交互项AB、AC、BC所对应的P值均大于0.05，说明各因素之间有一定的交互作用，但交互不显著。同时根据F值的大小可以得出3个因素对结果影响的主次顺序为A>C>B，即红茶菌接种量>发酵温度>初始糖度。

2.3.2 优化工艺确定和验证试验

经响应面回归分析得到的最优发酵工艺为红茶菌接种量17.08%，初始糖度18.29%，发酵温度30.30 ℃，在此条件下山药枸杞果醋总酸含量的理论值达到4.67 g/dL。根据实际的试验条件，将最佳工艺条件调整为红茶菌接种量17%，初始糖度18%，发酵温度30 ℃。在最佳条件下进行了3次验证试验，果醋总酸含量的平均值为4.65 g/dL，与理论预测值的相对误差较小，表明Box-Benhnken设计响应面法得到的发酵工艺是可信的。

2.4 山药枸杞果醋的质量指标

2.4.1 感官指标

色泽：淡红色；气味：具有果醋的特殊风味，气味纯正；滋味：酸甜适中，浓郁醇香，无异味；状态：澄清透亮，稳定均匀，无沉淀，无杂质。该果醋具有山药和枸杞的果香和醋香，其感官指标符合GB/T 18187—2000《酿造食醋》中的要求。

2.4.2 理化指标

总酸(以醋酸计)：4.65 g/dL；可溶性固形物含量为2.2%，符合GB/T 18187—2000《酿造食醋》中的具体要求。

2.4.3 微生物指标

菌落总数≤100 CFU/mL；大肠杆菌及其他致病菌未检出，该指标符合国家标准。

3 结论

以山药和枸杞为原料，利用红茶菌中的酵母菌、醋酸菌和乳酸菌等共生物协同对山药枸杞混合汁进行发酵，制备山药枸杞果醋。山药汁与枸杞汁的配比为4∶6，控制初始糖度为18%，红茶菌接种量为17%，于30 ℃条件下发酵5 d，得到果醋成品，总酸含量为4.65 g/dL。此工艺条件简单，易于控制，制得山药枸杞果醋的感官、理化和微生物指标均符合国家标准，且具有良好的风味。