胰腺导管腺癌组织miR-196b、TGFβR1表达变化及其意义

范婧怡，王健

郑州大学第二附属医院，郑州450003

胰腺癌是一种恶性程度很高的恶性肿瘤，患者预后极差，即使经积极治疗，患者5年总体生存率仍低于10%［1］。导管腺癌是胰腺癌最常见的病理类型，占80%～90%。胰腺导管腺癌早期诊断较为困难，患者就诊时多处于中晚期，治疗效果不理想［2］。目前，胰腺导管腺癌的病因和发病机制尚不十分清楚。因此，深入探索胰腺导管腺癌发病的分子机制，对寻找肿瘤早期诊断的分子标志物具有重要临床价值。微小RNA（miRNA）是一类无蛋白编码功能的RNA 分子，可通过其发夹结构，调控下游基因表达，从而参与多种生物学过程。大量研究表明，miRNA在多种恶性肿瘤组织中表达失调，从而影响肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡［3-4］。miR-196b 基因定位于人染色体7p15.2，能够参与下游靶基因的表达调控，如雷帕霉素靶蛋白，进而参与个体生长发育、脂肪细胞分化等生物学过程［5］。有研究报道，在肿瘤组织中miR-196b 表达上调，其表达上调能够通过促进Fas 等原癌基因表达，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力［6］。转化生长因子β 受体1（TGFβR1）基因定位于人染色体9q22.33，其编码的TGFβR1蛋白与TGFβ 结合后活化，从而激活下游信号通路，继而促进细胞的增殖、迁移。有研究报道，在人类肿瘤组织中TGFβR1 异常高表达［7］。此外，有学者报道TGFβR1 基因是miR-196b 新的作用靶点，miR-196b能在转录后水平促进TGFβR1 基因表达，从而促进肿瘤的恶性进展［8］。但目前鲜见胰腺导管腺癌组织miR-196b、TGFβR1 表达变化的报道。本研究观察了胰腺导管腺癌组织miR-196b、TGFβR1 表达变化，并探讨其表达变化与患者临床病理特征的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017 年4 月—2020 年1 月郑州大学第二附属医院收治的胰腺导管腺癌患者88例。纳入标准：①经术后组织病理学检查，符合胰腺导管腺癌诊断；②首次诊断；③接受胰腺癌根治性手术或姑息性手术治疗；④病历资料完整。排除标准：①合并急慢性胰腺炎者；②合并其他器官恶性肿瘤者；③合并心、肺、肾等重要脏器功能衰竭者。其中，男51 例、女37 例，年龄41～73（53.65 ± 6.8）岁；肿瘤直径：≤2 cm 47 例，＞2 cm 41 例；肿瘤位置：胰头部55 例，胰体尾部33 例；病理类型：腺癌59 例，腺鳞癌29 例；组织分化程度：高分化28 例，中低分化60 例；临床分期［9］：Ⅰ期35 例，Ⅱ、Ⅲ期53 例；有淋巴结转移48例，无淋巴结转移40例。本研究经郑州大学第二附属医院医学伦理委员会批准，所有患者或其家属知情同意并签属知情同意书。

1.2 miR-196b、TGFβR1 表达检测 取手术切除的胰腺癌组织和癌旁正常组织各约100 mg，液氮下充分研磨，采用TRIzol 法提取组织总RNA，经NanoDrop 2000 超微量分光光度计检测，提取的总RNA 浓度和纯度合格。然后将总RNA 反转录为cDNA。反转录条件：25 ℃15 min，40 ℃2 h。以cDNA为模板进行PCR 扩增。miR-196b 上游引物5"-TAC⁃CATCCTAGACCAGCGTGAC-3"、下游引物5"-ACCT⁃GGCGGCACTCCTTA-3"，U6 上游引物5′-GCGCCTC⁃GAGATGCCTTG-3"、下游引物3"-CTGGAGCGTGC⁃GTGGA-5"；TGFβR1上游引物5"-ACGGCGTTACAGT⁃GTTTCTG-3"、下游引物 5"-GCACATACAAACG⁃GCCTATCTC-3"，GAPDH 上游引物5"-TTAGCACG⁃CATCGCATAATG-3"、下游引物5"-TGGCAATACCTTT⁃GTTGTCATC-3"。PCR 反应体系共20 μL：模板cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，2×SYBR Green Master Mix 10 μL，双蒸水8 μL；反应条件：94 ℃3 min，94 ℃20 s、60 ℃30 s、70 ℃10 s 共40 个循环。所有操作在ABI 7500型实时荧光定量PCR仪上完成。采用2-ΔΔCT法计算miR-196b、TGFβR1相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0 统计软件。计量资料以±s表示，两样本均数比较采用独立样本t检验。相关性分析采用Pearson 线性相关分析法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胰腺癌组织与癌旁正常组织miR-196b、TGFβR1 表达比较 胰腺癌组织与癌旁正常组织miR-196b相对表达量分别为3.422±0.331、1.772±0.213，TGFβR1 相对表达量分别为2.145 ± 0.317、0.927 ± 0.114。胰腺癌组织miR-196b、TGFβR1 相对表达量均高于癌旁正常组织（t分别为39.324、33.917，P均＜0.05）。

2.2 胰腺癌组织miR-196b、TGFβR1 表达与患者临床病理特征的关系 见表1。

表1 胰腺癌组织miR-196b、TGFβR1表达与患者临床病理特征的关系

2.3 胰腺癌组织miR-196b 表达与TGFβR1 表达的关系 Pearson 线性相关分析显示，胰腺癌组织miR-196b相对表达量与TGFβR1相对表达量呈正相关关系（r=0.610，P＜0.05）。

3 讨论

胰腺导管腺癌是一种恶性程度非常高的消化系统肿瘤，其发病率和死亡率近年来呈明显上升趋势［10］。目前，外科手术仍然是胰腺导管腺癌最有效的治疗手段，但其起病隐匿，进展迅速，多数患者首诊时即已错过了最佳手术时机。即使能够接受外科手术，术后也易出现复发和转移，患者预后较差［11］。目前，胰腺导管腺癌的病因和发病机制尚不清楚，普遍认为是一个多基因参与、多阶段发展的复杂生物学过程，涉及原癌基因活化、抑癌基因功能缺失。深入探索胰腺导管腺癌发病的分子机制，将有助于胰腺导管腺癌的早期诊断和靶向治疗。

miRNA 位于基因间区或内含子区域，在核内由RNA 聚合酶Ⅱ转录后进一步被切割产生具有茎环结构的前体miRNA，经Dicer 酶降解后成为成熟miRNA，加入到RNA 诱导的沉默复合物中，通过与靶基因mRNA 结合，从而调控靶基因mRNA 降解或阻遏其转录后翻译。miRNA 表达失调能够影响肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡，在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。miR-196b是miRNA 家族成员之一，基因定位于人染色体7p15.2，能够在转录后水平调控其下游基因的表达，继而参与机体的生长、发育等生物学过程。近年研究发现，miR-196b 在肝癌、胃癌等恶性肿瘤组织中表达上调，其表达上调能够通过激活AKT 信号通路，促进下游血管内皮生长因子等癌基因的表达，导致肿瘤恶性进展［12］。本研究结果发现，胰腺癌组织miR-196b 表达上调，提示miR-196b 可能作为一种促癌基因参与胰腺导管腺癌的发生、发展。但目前miR-196b 在胰腺导管腺癌组织中表达上调的机制尚不明确，可能与其上游调控分子长链非编码RNA（lncRNA）有关。有学者报道，lncRNA HOXA10 能够结合miR-196b 基因的启动子区，抑制miR-196b 表达，当细胞恶变后，lncRNA HOXA10基因启动子区甲基化，导致lncRNA HOXA10表达降低、miR-196b表达升高，从而促进其下游癌基因的表达，继而导致肿瘤恶性进展［13］。本研究结果亦发现，胰腺癌组织miR-196 表达与肿瘤组织分化程度、临床分期和淋巴结转移有关，表明miR-196b 表达上调能够促进胰腺导管腺癌进展，其机制可能与miR-196b 能够促进其下游靶基因（如GATA6）表达有关。GATA6是miR-196b的直接作用靶点，可抑制细胞的增殖和迁移能力，而miR-196b高表达能够降低GATA6 mRNA 的稳定性，从而抑制GATA6的抑癌作用［14］。

肿瘤的发生、发展过程中存在多条信号传导通路过度活化现象，其中TGFβ 信号传导通路激活在肿瘤的发生、发展中具有重要作用。TGFβR1 是TGFβ 信号传导通路的关键受体之一，位于细胞表面，在与肿瘤微环境中的TGFβ 结合后，通过经典和非经典激活途径，促进SMAD 等转录因子活化，从而影响其下游靶基因的表达。在生理状态下，TGFβR1 能够参与细胞正常的增殖和迁移等生物学过程，但在肿瘤发生时TGFβR1激活，促进了肿瘤细胞侵袭和迁移。本研究结果发现，胰腺癌组织TGFβR1表达升高，提示TGFβR1可能参与胰腺导管腺癌的发生、发展，其原因与调控TGFβR1表达的基因异常有关。有研究报道，肿瘤发生时具有靶向抑制TGFβR1 表达功能的miR-142-3p 表达降低，进而引起TGFβ 下游通路的过度活化［15］。本研究结果还发现，胰腺癌组织TGFβR1 表达与肿瘤组织分化程度、临床分期和淋巴结转移有关，提示TGFβR1能够参与胰腺导管腺癌进展，其机制与TGFβR1 能够参与调控上皮间质转化相关基因的表达有关。有研究报道，TGFβR1 活化能够促进Snail1、Twist 等转录因子表达，导致上皮标志物E-钙黏素表达降低，而间充质标志物波形蛋白表达升高，引起细胞上皮间质转化，导致肿瘤易发生局部浸润和远处转移［16］。

本研究结果还发现，胰腺癌组织miR-196b 表达与TGFβR1 表达呈正相关关系。目前miR-196b 与TGFβR1 在胰腺导管腺癌中相互作用的机制尚不清楚，可能与miR-196b 能够增强TGFβR1 表达有关。有研究表明，miR-10b、miR-346 等多种miRNA 能够与靶基因的5′端非编码区结合，并通过与翻译调控元件相互作用，从而激活靶基因的表达［17］。此外，有研究还发现，肿瘤微环境中TGFβ 表达升高，并通过结合肿瘤细胞表面的TGFβR1，诱导miR-196b 表达上调，进而影响上皮间质转化的关键转录因子表达，从而促进肿瘤恶性转化［18］。

综上所述，胰腺导管腺癌组织miR-196b、TGFβR1 表达上调，二者可能协同参与胰腺导管腺癌的发生、发展。