卡马西平对癫痫模型大鼠海马损伤作用及对Fascin-1、突触素表达的影响

朱百科，王新新

癫痫主要是由于大脑神经元异常放电导致发病，引起脑功能短暂失调，影响运动感觉、行为意识和精神状态。癫痫反复发作对病人的身心健康产生严重伤害，其中20%～30%的癫痫病人会引发认知功能、精神行为障碍，进而向难治性癫痫发展[1]。卡马西平是临床常用的抗癫痫药物，其治疗窗较窄，长期应用会导致病人发生低钠血症、致畸、造血功能障碍，对生活质量产生严重影响[2]。目前临床应用时为了避免其副作用，提高治疗效果，采用卡马西平联合中药进行治疗[3]。肌成束蛋白(Fascin-1)与F-肌动蛋白结合形成细胞骨架蛋白，参与细胞形态学、功能发展过程。Fascin-1通过实现肌动蛋白捆绑，促进树突棘形成以及囊泡转运，在突触重塑过程中发挥着重要作用[4]。突触素(synaptophysin，SYP)属于一种钙结合糖蛋白，与突触结构和功能有关，主要在神经元突触小泡分泌细胞中存在，是突触前终末的特异性标记物，参与突触囊的导入、转运过程，在神经递质释放、突触囊泡再循环以及突触发生具有重要作用[5]。本研究观察卡马西平对癫痫模型大鼠海马损伤的作用及对Fascin-1、突触素表达的影响，为治疗癫痫提供临床依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择54只无特定病原体动物(SPF)级SD健康大鼠，由基尔顿生物科技(上海)有限公司提供。鼠龄4～10(6.8±0.5)周，体质量210～260(230.4±21.5)g，饲养温度为22～25 ℃，室内湿度35%～40%，饲养室定时进行紫外线照射消毒。统一喂标准饲料，允许自由活动，饲养时间为1周。本研究所做实验均获得山东省立第三医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 癫痫模型建立 选取40只大鼠，参考文献[6]方法造模，大鼠麻醉后固定于立体定向仪上，充分暴露前囟，在前囟后0.8 mm，中线旁开1.3 mm，硬膜下3.7 mm，使用5 mL规格注射器，向侧脑室内注射1 μg/μL海人酸溶液，在10 min内注射完，留针5 min后，拔除针头，对头皮进行缝合。随后观察大鼠前肢、后肢阵挛、站立、跌倒、咀嚼点头、面部抽动症状表现，根据Racine分级标准判断大鼠癫痫持续状态处于几级表现，当大鼠症状表现为Ⅳ～Ⅴ级，则说明癫痫大鼠模型建立成功。本研究因过度抽搐导致死亡4只。

1.2.2 用药干预 40只模型大鼠随机分为模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，各10只，另10只正常组，低剂量组、中剂量组、高剂量组给予卡马西平(质量浓度2 g/L)进行治疗，剂量分别为15 mg/kg、30 mg/kg、50 mg/kg，每天1次。模型组和正常组给予等体积的无菌生理盐水进行干预。

1.2.3 脑电图相关指标检测 所有大鼠用药干预1个月后，采用脑电图机(美国韦迪公司EB Neuro系统)对脑电数据进行采集。将大鼠固定在固定器中，带上自制眼罩，放置电极。采用单导针刺电极记录大鼠脑电图，电极放于C4区，在同侧耳部，接地电极在大鼠尾部。电压设置为10 μV/mm，时间设置为0.3 s，纸速为12 mm/s，高频率波为35 Hz。数据记录时间为20 min，主要观察各组大鼠潜伏期、持续时间、波幅指标。

1.2.4 发作次数、发作总时间统计 大鼠开始用药后，使用摄像机每天记录大鼠癫痫发作情况。0级：无抽搐发作；1级：大鼠仅面部抽搐，有咀嚼动作，并伴随湿狗样抖动；2级：大鼠头颈部肌肉痉挛，出现点头、甩头动作；3级：单侧前肢阵挛；4级：大鼠后肢站立，双侧前肢阵挛；5级：大鼠后肢失去平衡，常跌倒，双侧前肢阵挛加重，并且全身出现强直阵挛。观察1周并统计所有大鼠发作次数、发作总时间。

1.2.5 海马区细胞凋亡指数观察 所有大鼠腹腔注射3.0% 80 mg/kg戊巴比妥麻醉后，取大鼠脑组织，并迅速分离出海马组织，使用液氮进行快速冷冻后，在温度为-70 ℃的环境下保存，常规脱水、浸蜡、包埋后，连续石蜡切片，进行苏木精-伊红染色法(HE)染色处理后观察大鼠海马区神经元状况。半定量法检测大鼠海马区细胞凋亡指数，细胞核中发现紫色、深蓝褐色颗粒表示为阳性染色。每张切片选择3个不同视野取平均数，统计大鼠海马区细胞凋亡指数。采用原位细胞凋亡检测法对切片进行染色，细胞核中发现紫、深蓝褐色颗粒表示为阳性染色即为神经元凋亡细胞。

1.2.6 Fascin-1、突触素、Bcl-2、Bax表达水平检测 采用蛋白质印迹法(Western Blot)检测，将采集到的标本离心处理10 min，取出上清液，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白定量，将50 μg蛋白加入2×SDS凝胶加样缓冲液中，100 ℃加热处理5 min促使蛋白变性。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳完成后进行转膜，结束后取下硝酸纤维素膜，在5%脱脂牛奶中4 ℃下封闭1 h，封闭结束后，加一抗使用0.05%～0.1% TBST给予稀释(Fascin-1、突触素、Bcl-2、Bax一抗为1∶1 000)，4 ℃孵育过夜保存，之后使用0.05%～0.1% TBST洗膜，3次，每次为5 min，加二抗使用0.05%～0.1% TBST给予稀释(1∶10 000)，室温摇动孵育 1 h，最后使用0.05%～0.1% TBST洗膜，3次，每次5 min。采用DAB染色试剂盒显色，光密度扫描后进行定量分析。以GAPDH为内参。

2 结 果

2.1 卡马西平对癫痫模型大鼠脑电图相关指标的影响 模型组潜伏期低于正常组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，持续时间、波幅高于正常组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)；卡马西平各剂量组潜伏期高于模型组，持续时间、波幅低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)；中剂量组潜伏期高于低剂量组和高剂量组，持续时间、波幅低于低剂量组和高剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)；低剂量组和高剂量组潜伏期、持续时间、波幅比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠脑电图相关指标水平比较(±s)

2.2 卡马西平对癫痫模型大鼠发作次数、发作总时间的影响 模型组发作次数、发作总时间高于低剂量组、中剂量组、高剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)；中剂量组发作次数、发作总时间低于低剂量组和高剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)；低剂量组和高剂量组发作次数、发作总时间比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠癫痫发作次数、发作总时间比较(±s)

2.3 卡马西平对癫痫模型大鼠海马区细胞凋亡情况的影响 模型组海马区细胞凋亡指数高于正常组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，差异具有统计学意义(P<0.05)；中剂量组海马区细胞凋亡指数低于低剂量组和高剂量组，差异具有统计学意义(P<0.05)；低剂量组和高剂量组海马区细胞凋亡指数比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠海马区细胞凋亡指数比较(±s)

各组大鼠海马区细胞凋亡HE染色显示，模型组神经元细胞减少，排列无规律，皱缩、核裂解，核仁模糊不清，中剂量组明显改善了海马区细胞凋亡、神经元损伤状况。详见图1。

图1 各组大鼠海马区细胞凋亡情况(HE染色，×200)

2.4 卡马西平对癫痫模型大鼠Fascin-1、突触素、Bcl-2、Bax表达水平的影响 模型组Fascin-1、Bcl-2表达水平低于正常组、低剂量组、中剂量、高剂量组，突触素、Bax表达水平高于正常组、低剂量组、中剂量、高剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)；中剂量组Fascin-1、Bcl-2表达水平高于低剂量组和高剂量组，突触素、Bax表达水平低于低剂量组和高剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)；低剂量组和高剂量组Fascin-1、突触素、Bcl-2、Bax表达水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表4。Western Blot检测各组癫痫大鼠Fascin-1、突触素、Bcl-2、Bax表达结果见图2。

表4 各组大鼠Fascin-1、突触素、Bcl-2、Bax表达水平比较(±s)

图2 Western Blot检测各组大鼠Fascin-1、突触素、Bcl-2、Bax表达比较

3 讨 论

癫痫属于一种脑神经疾病，临床主要采用药物进行治疗。卡马西平能降低血脑屏障透过率，降低脑组织中有效浓度，主要是通过肝和肠道代谢，与其他药物联用，能抑制CYP3A4代谢酶，升高卡马西平血药浓度[7-8]。卡马西平在临床应用中需要对病人的血药浓度进行监测，最大限度地降低其在治疗癫痫过程中的毒副作用[9]。

本研究结果显示，卡马西平干预后大鼠潜伏期提高，持续时间、波幅降低，说明卡马西平能改善大鼠脑电图相关指标，中剂量组潜伏期升高，持续时间、波幅低，说明中剂量卡马西平作用效果最明显。薛韬等[10]研究指出，定痫颗粒联合卡马西平可改善大鼠脑电图相关指标潜伏期、持续时间、波幅，从而改善大鼠临床症状。卡马西平干预后大鼠癫痫发作次数、发作总时间降低，中剂量组发作次数、发作总时间最低，说明中剂量卡马西平改善大鼠临床症状效果更佳，促进恢复。

癫痫发病后导致神经元细胞凋亡，因此，神经元细胞凋亡能间接反映癫痫的发作程度[11]。本研究显示，中剂量组海马区细胞凋亡指数最低，说明中剂量卡马西平能降低大鼠海马区细胞凋亡状况，改善神经元凋亡状况。Fascin-1不足或者是调节功能异常，会影响大脑发育和可塑性失常。在大鼠失神发作模型中，Fascin-1蛋白水平表达降低，在神经活动中下调Fascin-1水平，会引起突触结构改变[12]。神经元培养模型研究中，Fascin-1发生分解降低，伴随着树突棘短暂回缩，主要是受肌动蛋白束的分解影响，促进突触重塑[13]。目前Fascin-1在癫痫中的表达相关研究较少。突触素密度和分布情况能间接反映机体突触的数量和分布状况，也是突触重建和神经可塑性的关键[14]。随着研究的不断深入，发现突触素在癫痫病人以及癫痫动物模型中研究越来越广，在评估突触重建可塑性变化方面发挥着重要作用[15]。相关研究显示，癫痫发作过程中海马内突触素表达增强，在慢性期伴随轴突增生和突触重建发生，突触素异位表达以及表达增强与癫痫慢性自发发作有关[16]。Bcl-2、Bax均属于Bcl-2基因家族成员，其中Bcl-2是一种凋亡抑制基因，Bax基因是一种凋亡诱导基因，与细胞的凋亡、增殖具有一定的相关性[17-18]。Bcl-2参与细胞凋亡，主要存在于内质网、核膜的胞质面及线粒体外膜中，主要是通过与膜结合发挥作用。Bcl-2蛋白是线粒体PT孔道的主要组成成分，pH较高会形成离子通道，Bax在pH范围内促进孔道形成，有助于离子以及小分子物质穿过线粒体膜，进入到胞质，导致细胞凋亡。Bcl-2作用与Bax作用正相反，能封闭孔道活性，降低分子通透性，从而抑制大鼠海马区细胞凋亡[19-20]。本研究指出，中剂量卡马西平Fascin-1、Bcl-2表达水平最高，突触素、Bax表达水平降低，说明中剂量卡马西平作用效果最显著，通过调控Fascin-1、Bcl-2、突触素、Bax表达水平，降低海马区细胞凋亡指数，改善神经元细胞凋亡状况。

综上所述，卡马西平能降低癫痫模型大鼠海马损伤程度，起到一定的抗癫痫作用，可能与调控Fascin-1、突触素、Bcl-2、Bax表达水平有关。