基于Nrf2通路研究丹参酮ⅡA对自发性高血压大鼠血压及血管活性物质的影响

李文娣，孙 娟

自发性高血压是一种以高血压为主要临床表现且病因不明的疾病，是中风、冠心病和其他高风险疾病的主要危险因素，自发性高血压占高血压发病率的90%，且发病率逐年上升[1-2]。因此，有效控制血压仍然是全球公共卫生问题。转录因子NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)是一种关键转录因子，正常生理状态下，Nrf2存在于细胞质中，氧化应激状态下Nrf2从细胞质进入到细胞核内，与抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)结合后，启动下游靶基因，调节血红素氧合酶1(heme oxygenase 1，HO-1)、依赖还原型辅酶/Ⅱ醌氧化还原酶Ⅰ[NAD(P)H：quinone oxidoreductase 1，NQO1]等的转录活性[3]。丹参酮ⅡA是从丹参的根中分离出的天然二萜醌，具有促进血液循环和缓解血管瘀滞作用[4]。丹参酮ⅡA可有效治疗冠心病、脑血管疾病和心血管疾病[5-6]，还具有抗氧化、抗炎和抗癌活性，丹参酮ⅡA硫酸钠通过激活大鼠Nrf2信号通路保护心肌免受百草枯诱导的毒性反应[7]。本研究分析丹参酮ⅡA是否通过Nrf2通路对自发性高血压大鼠(SHR)有治疗作用，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 丹参酮ⅡA(纯度98%)购自成都普瑞法公司。苯那普利购自上海新亚药业闵行有限公司。60只体质量180～220 g雄性自发性高血压大鼠和15只体质量180～220 g健康雄性Wistar-Kyoto(WKY)大鼠，均购自新疆医科大学动物实验中心。苏木精-伊红(HE)染色试剂盒和免疫组化试剂盒购自武汉华联科生物技术有限公司。酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒、RIPA裂解液和AT1R抗体购自美国Abcam公司。Nrf2、HO-1、NQO1、β-actin抗体和山羊抗兔IgG二抗购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与给药 15只WKY大鼠为空白对照组；60只雄性自发性高血压大鼠分为自发性高血压组、丹参酮ⅡA低剂量组(25 mg/kg)、丹参酮ⅡA高剂量组(50 mg/kg)[8]和苯那普利组(10 mg/kg)[9]，每组15只。空白对照组和自发性高血压组大鼠每天给予相同剂量的生理盐水，用药组大鼠每天灌胃给予相应剂量的药物，连续给药8周。

1.2.2 血压测量 使用尾套法在大鼠清醒时测定收缩压，在给药前及给药1周、5周、8周时分别测量收缩压测量。将大鼠置于37 ℃恒温固定器中约10 min。用连接到尾套装置的适当尺寸管状尾套闭塞大鼠尾巴。通过XH200恒温无创血压计和MD3000生物信号采集与处理系统测量大鼠的收缩压。每次测量3次，取平均值。

1.2.3 眼底检查 大鼠用10%水合氯醛麻醉后，使用眼底照相术进行眼底检查。在末次给药结束后，眼底照相机观察和拍摄视神经基底。通过检查眼底直接观察小动脉变化。

1.2.4 取材、固定与保存 实验结束时，将所有禁食12 h的大鼠称重并用10%水合氯醛麻醉，然后从心尖部采血于离心管中，1 500 r/min，离心15 min后取血清，于-80 ℃保存。取血结束后，立即取出胸主动脉，用生理盐水清洗干净。胸主动脉分成2份，一半胸主动脉放入4%多聚甲醛中固定，另一半胸主动脉速存于-80 ℃中。

1.2.5 病理学观察 将胸主动脉包埋于石蜡中，然后通过切片、展片烤片、HE组织学染色测定，并在光学显微镜下观察其病理变化。

1.2.6 血管活性物质检测 采用ELISA法测定各组大鼠所采集血清中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、内皮素(ET)、去甲肾上腺素(NE)和血栓素B2(TXB2)含量。

1.2.7 AngⅡ的受体(ATIR)阳性表达 将胸主动脉包埋于石蜡中，通过切片、展片烤片、脱水，3%过氧化氢溶液去除内源性过氧化物酶，滴加非免疫动物血清20 min，滴加一抗、PBS冲洗、滴加二抗、冲洗后加ABC复合物、DAB显色，在光学显微镜下观察，按照免疫组化染色阳性细胞数在每一高倍视野中所占比例依次统计，用Image Pro Plus图像分析软件进行分析。

1.2.8 免疫印迹法(Western Blot)检测 取胸主动脉并(100 mg)置于加有1 mL制备好的RIPA裂解液中，充分研磨提取蛋白，使用Lowry方法定量总蛋白质含量。用SDS-PAGE凝胶分离蛋白质并转移到PVDF膜上。含有5%脱脂牛奶的PBS封闭膜1 h，洗去多余的脱脂奶粉。加入稀释后的Nrf2、HO-1、NQO1和β-actin一抗，4 ℃摇床上孵育过夜。TBST洗膜3次，加入对应于一抗种属来源稀释后的二抗，室温下，在摇床上孵育1 h，TBST洗膜3次。使用ECL化学发光液显色发光，凝胶成像系统拍照，Image Pro Plus图像分析系统对蛋白条带进行分析。

2 结 果

2.1 丹参酮ⅡA对大鼠收缩压的影响 给药前，空白对照组大鼠血压正常，自发性高血压组大鼠血压升高(P<0.01)，其余组大鼠血压与自发性高血压组大鼠比较无明显变化；给药1周后，用药组大鼠血压无明显变化；给药5周后，丹参酮ⅡA低剂量、丹参酮ⅡA高剂量组和苯那普利组大鼠血压较自发性高血压组下降(均P<0.05)；给药8周后，与自发性高血压组比较，丹参酮ⅡA低剂量、丹参酮ⅡA高剂量组大鼠血压均下降(均P<0.05)，苯那普利组大鼠血压明显下降(P<0.01)。详见表1。

表1 各组大鼠收缩压比较 (±s) 单位：mmHg

2.2 丹参酮ⅡA对大鼠胸主动脉形态学的影响 肉眼形态学观察显示(见图1)，与空白对照组比较，自发性高血压组有明显的内皮损伤和血管弹性降低，丹参酮ⅡA低剂量、丹参酮ⅡA高剂量和苯那普利降低了血管内皮损伤并增加了血管弹性，其中苯那普利最为明显。

图1 肉眼观察胸主动脉的形态

HE染色结果显示(见图2)，自发性高血压组大鼠胸主动脉壁明显增厚，内膜表面不光滑，内皮连续性差，内皮细胞排列不规则，形态不规则，平滑肌细胞紊乱。丹参酮ⅡA低剂量、丹参酮ⅡA高剂量和苯那普利组大鼠胸主动脉的内皮相对平滑，内皮细胞排列整齐。

图2 HE染色观察各组大鼠胸主动脉病理情况 (×200)

2.3 丹参酮ⅡA对大鼠视网膜动脉的影响 在末次给药结束后，空白对照组大鼠视网膜动脉直径正常，自发性高血压组大鼠视网膜动脉直径略窄，丹参酮ⅡA低剂量、丹参酮ⅡA高剂量和苯那普利均逆转了这一现象，大鼠视网膜动脉直径变宽，其中苯那普利组效果最明显。详见图3。

图3 通过眼底照相观察各组大鼠视网膜动脉的直径

2.4 丹参酮ⅡA对血管活性物质的影响 与空白对照组比较，自发性高血压组大鼠血清中AngⅡ、ET、NE和TXB2含量均明显增加(均P<0.01)；与自发性高血压组相比，丹参酮ⅡA低剂量、丹参酮ⅡA高剂量和苯那普利能降低AngⅡ、ET、NE和TXB2的含量(P<0.05或P<0.01)。详见表2。

表2 各组大鼠血管活性物质的表达水平比较 (±s)

2.5 丹参酮ⅡA对AT1R表达的影响 AT1R的免疫组织化学结果显示阳性染色为褐色，主要分布在胸主动脉血管内皮细胞和平滑肌细胞的膜或细胞质中。AT1R在空白对照组中呈弱阳性，在丹参酮ⅡA低剂量、丹参酮ⅡA高剂量和苯那普利组中阳性表达降低，其中苯那普利组最明显。详见图4、表3。

图4 免疫组化观察大鼠胸主动脉中ATIR的阳性表达(×200)

表3 各组大鼠胸主动脉中AT1R的阳性表达率比较(±s) 单位：%

2.6 丹参酮ⅡA对Nrf2通路相关蛋白的影响 与空白对照组比较，自发性高血压组大鼠胸主动脉中Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表达量降低(均P<0.01)；与自发性高血压组相比，丹参酮ⅡA低剂量、丹参酮ⅡA高剂量和苯那普利组大鼠胸主动脉中Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表达量明显增加(P<0.05或P<0.01)。详见图5、表4。

图5 Western Blot测量各组大鼠胸主动脉中Nrf2通路相关蛋白的表达情况

表4 各组大鼠胸主动脉中Nrf2通路相关蛋白的表达情况(±s)

3 讨 论

自发性高血压是一种原因不明的心血管疾病，与许多因素有关。它主要由血压升高引起，严重威胁人类健康[10]。中医学认为高血压病主要是由素体禀赋不足、内伤虚损、饮食失调等多种因素引起，致使阴阳消长失调，进而出现损阴、伤阳、络脉失养等变化。而气血逆乱、络脉损伤会导致一系列脑、心、肾合并症的发生。因此，中医药及其配方在治疗高血压方面受到了广泛关注，具有广阔的临床应用前景和研究价值。

Nrf2是一种转录因子，负责调节哺乳动物的细胞氧化还原平衡、保护性抗氧化剂和Ⅱ期解毒反应[11]。Nrf2激活后进入细胞核能与ARE结合，进而上调下游抗氧化基因HO-1、NQO1的表达[12]。HO-1能保护细胞免受氧化损伤，调节细胞凋亡，调节炎症以及促进血管生成而发挥有益作用。另一方面，HO-1水平的紊乱与一些年龄依赖性疾病的发病机制有关，包括神经变性、癌症或黄斑变性[13]。NQO1的表达与Nrf2的激活有关，其在抗氧化过程中起着至关重要作用[14]。研究表明，芦丁对大鼠体内Kim-1/NF-κB/Nrf2信号通路调控氟化钠诱导的高血压有改善作用[15]。

丹参味苦、微寒、无毒，属于唇形科植物，其根部提取物丹参酮ⅡA有疏通血管、改善微循环、抗炎、增强免疫力等作用，在临床上作为一种保护心脏、保肝，甚至作为抗致癌物质[16]。研究发现，丹参酮ⅡA在高血压发病过程中通过失活PDK1预防大鼠基底动脉平滑肌细胞增殖[17]。

本实验中，丹参酮ⅡA低剂量、高剂量均能降低大鼠血压，提示丹参酮ⅡA对自发性高血压有一定的治疗作用。通过肉眼观察各组大鼠胸主动脉，发现丹参酮ⅡA低剂量、高剂量均能降低血管内皮损伤，并增加血管弹性，说明丹参酮ⅡA对主动脉有保护作用。HE染色结果也表明，丹参酮ⅡA低剂量、高剂量均能使大鼠胸主动脉的内皮相对平滑，内皮细胞排列整齐。视网膜血管直径是评估微血管重塑的重要指标，丹参酮ⅡA低剂量、高剂量均可改善因高血压引起的大鼠视网膜动脉直径变窄现象，这表明丹参酮ⅡA改善了高血压引起的微血管功能障碍。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)在高血压的发生和发展中起重要作用，是调节血压的关键机制。RAAS的过度激活是高血压的主要原因之一[18]。AngⅡ是RAAS中的重要物质且在AT1R中起着重要作用，可引起血管收缩，刺激醛固酮分泌，增加水钠潴留，刺激交感神经活动，并提高血压。丹参酮ⅡA低剂量、高剂量降低AngⅡ、ET、NE和TXB2的含量，说明丹参酮ⅡA能抑制RAAS的激活，进一步控制血压。AT1R是Ang Ⅱ的主要受体，其介导血管阻塞，促进血管平滑肌细胞在高血压发展中的增殖作用，起着重要作用[19]。丹参酮ⅡA低剂量、高剂量能降低AT1R的阳性表达，提示丹参酮ⅡA能抑制AngⅡ的活性，降低血压。丹参酮ⅡA低剂量、高剂量能明显提高大鼠胸主动脉中Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表达量，说明丹参酮ⅡA能激活Nrf2通路，调控大鼠血压变化。

丹参酮ⅡA对自发性高血压大鼠具有明显的降压作用，其机制可能与抑制血管活性物质的表达，激活Nrf2通路有关。丹参酮ⅡA作为丹参根部的提取物，属于天然药物，因此，开发丹参酮ⅡA为先导化合物新型药物，为今后预防以及治疗高血压疾病奠定了基础。