新生儿缺氧缺血性脑病血清HIF-1α、miR-210水平与NBNA评分的相关性

温晓敏，焦 蓉，张爱明，叶明阳，王文翔

新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是新生儿因围生期窒息引起中枢神经缺氧缺血性颅脑损伤[1]。HIE是婴幼儿神经系统功能障碍的主要原因，属于新生儿常见疾病，致死率较高，预后较差，临床上缺少有效病情诊断的分子标志物[2]。新生儿行为神经测定(neonatal behavioral neurological assessment，NBNA)评分是早期评估新生儿中枢神经系统功能受损和预后的敏感指标。相较于头颅CT、Sarnat分度等方法，NBNA评分具有更高的特异性、敏感度，且更为简便、全面[3]。低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1 alpha，HIF-1α)与HIE发生有关，其作用是在氧分压较低的环境下维持细胞稳态[4]。微小RNA-210(microRNA-210，miR-210)是miRNA一员，参与生物体细胞增殖、分化、凋亡等[5]。研究表明，miR-210与新生儿HIE密切相关[6]。NBNA评分及HIF-1α、miR-210均能在一定程度上反映HIE病情发展，因此，若将NBNA评分与HIF-1α、miR-210测定联合，对疾病诊断可能更加全面。但目前探讨三者在新生儿HIE病情发展中的相关性，从而将HIF-1α、miR-210及NBNA评分联合应用于新生儿HIE早期诊断的研究较少。因此，本研究通过检测HIE新生儿血清中HIF-1α、miR-210水平，同时测定NBNA评分，探讨二者与NBNA评分之间的相关性，从而为临床上开发新生儿HIE病情的诊断指标提供新思路，对评价其早期危险性具有重要意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年3月—2019年2月本院收治的80例HIE新生儿为研究对象(HIE组)，同期选取75名正常新生儿作为对照组。纳入标准：①符合中华医学会儿科分会新生儿组学对新生儿HIE的诊断标准[7]；②临床资料齐全者；③出生24 h内入院者；④母孕期体健，无烟酒等不良嗜好者。排除标准：①伴有心肺疾病者；②伴有其他并发症及感染性疾病者；③先天性畸形者；④先天性遗传代谢性疾病者。本试验经医院临床研究伦理委员会批准，符合伦理学标准，所有研究对象均由专业人员详细告知家长研究内容并同意参加，并签署知情同意书。收集两组一般资料，包括胎龄、性别、出生体重等，记录Apgar评分，包括肌张力、脉搏、皱眉动作即对刺激的反应、外貌、呼吸，理论最高值10分。

1.2 主要试剂与仪器 缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)分析检测试剂盒(货号：FK-KJ0389)，购自上海樊克生物科技有限公司；RNA提取试剂盒(货号：dp419)，购自北京天根生化有限公司；AceQ qPCR SYBR®Green Mix(货号：Q111-02)，购自南京诺唯赞生物科技有限公司；miScript SYBR®Green qPCR Kit(货号：218076)，购自德国QIAGEN公司。ABI7700实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)仪，购自美国Applied Biosystems公司。

1.3 研究方法

1.3.1 样品采集及保存 抽取两组新生儿清晨空腹静脉血，3 000 r/min离心15 min后收集血清，置于-80 ℃保存待测。

1.3.2 检测血清相关指标 检测血清相关指标，包括血清总钙(calcium，Ca)、血清天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate amino transferase，AST)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)水平。

1.3.3 检测血清中HIF-1α水平 ELISA法检测两组新生儿血清HIF-1α水平，检测方法严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.4 检测血清miR-210水平 采用qRT-PCR法检测两组新生儿血清miR-210水平。采用RNA提取试剂盒提取血清总RNA，反转录得cDNA。采用qRT-PCR仪对miR-210进行扩增。qRT-PCR反应体系共10 μL：cDNA(50 ng/μL)1 μL，miScript SYBR®Green Mix 5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O 3.0 μL，引物由上海生工生物公司合成。反应条件：95 ℃、10 min；95 ℃、30 s，58 ℃、1 min，40个循环；72 ℃，10 min。miR-210及内参U6引物序列见表1。采用2-△△CT法对血清miR-210表达水平进行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.5 新生儿NBNA评分检测 新生儿出生后均于第7天进行NBNA评分，检测项目主要包括：主动肌张力、被动肌张力、新生儿行为能力、原始反射、一般反应。满分40分，NBNA评分>36分者正常，35～36分者临界异常，<35分者异常。

1.4 统计学处理 采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析。定量资料以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验；定性资料采用χ2检验；采用Pearson法分析HIE新生儿血清HIF-1α、miR-210水平与NBNA评分的相关性；Logistic回归分析新生儿HIE的影响因素。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组一般资料比较 两组胎龄、性别、出生体重比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。HIE组Apgar评分明显低于对照组(P<0.05)。详见表2。

表2 两组临床资料比较

2.2 两组血清HIF-1α、miR-210水平及NBNA评分比较 HIE组血清HIF-1α、miR-210水平明显高于对照组(P<0.05)，NBNA评分明显低于对照组(P<0.05)。详见表3。

表3 两组血清HIF-1α、miR-210水平及NBNA评分比较 (x±s)

2.3 两组血清相关指标比较 两组血清Ca比较，差异无统计学意义(P>0.05)。HIE组血清AST、LDH、CK、CK-MB水平明显高于对照组(P<0.05)。详见表4。

表4 两组血清相关指标比较 (x±s)

2.4 HIE新生儿血清HIF-1α、miR-210水平与NBNA评分的相关性 Pearson法分析结果显示，HIE新生儿血清HIF-1α、miR-210水平与NBNA评分均呈负相关(r值分别为-0.559、-0.567，P均<0.05)。详见图1、图2。

图1 HIE新生儿血清HIF-1α水平与NBNA评分的相关性

图2 HIE新生儿血清miR-210水平与NBNA评分的相关性

2.5 HIE新生儿HIF-1α、miR-210及NBNA评分与血清相关指标的相关性 Pearson法分析结果显示，HIE新生儿血清AST、LDH、CK、CK-MB与HIF-1α、miR-210呈正相关(P<0.05)，与NBNA评分呈负相关(P<0.05)。详见表5。

表5 HIE新生儿HIF-1α、miR-210及NBNA评分与血清相关指标的相关性

2.6 影响新生儿HIE的多因素分析 将新生儿是否发生HIE作为因变量，以HIF-1α、miR-210、NBNA评分、Apgar评分、AST、LDH、CK、CK-MB为自变量进行Logistic回归分析，结果显示，HIF-1α、CK-MB是影响新生儿HIE的危险因素，NBNA评分是影响新生儿HIE的保护因素。详见表6。

表6 影响新生儿HIE的多因素分析

3 讨 论

新生儿HIE发病机制较为复杂，新生儿发生HIE后脑能量代谢衰竭，大量中性粒细胞及氧自由基相互作用导致新生儿脑功能出现损伤，是临床上围生期新生儿致残甚至死亡的主要原因之一[8]。新生儿HIE会引发多种神经系统后遗症，使得社会整体人口素质降低，家庭生活质量也严重下降[9]。因此，寻找早期评估和诊断脑损伤的指标，对临床上新生儿HIE治疗和预后有重要意义。

HIF-1α受缺氧信号调控，其C末端是活性调控区域，能感受缺氧信号[10]。当机体缺氧时，HIF-1α聚集并与HIF-1β结合形成复合物，进而激活下游相关靶基因，调节一系列生长介质和细胞因子变化从而对疾病造成影响。HIE发生时，HIF-1α通过激活凋亡相关基因，使脑组织适应缺氧环境，从而发挥重要作用[11]。miR-210参与缺氧缺血环境下脏器组织出现的血管新生，与供血和保护神经元作用关系密切。miR-210能调节神经系统发育，脑缺血损伤后miR-210参与组织损伤后的神经发生过程。且miR-210能破坏HIE血脑屏障完整性，诱导HIE新生儿出现脑水肿[12]。NBNA评分是一项简单实用的用于新生儿中枢神经系统受损及HIE预后评定的方法[13]，是北京协和医院儿科主任鲍秀兰教授以美国和法国新生儿行为神经测定法为基础，结合临床经验而创定的评分方法，20个项目共40分，具有较好的特异性和灵敏度。郭颖等[13]通过检测HIE患儿血清HIF-1α水平并对其进行NBNA评分，证明HIE患儿血清HIF-1α水平随病情加重而升高，且与NBNA评分呈负相关。本研究结果显示，HIE组血清HIF-1α、miR-210水平明显高于对照组，NBNA评分明显低于对照组；HIE新生儿血清HIF-1α、miR-210水平与NBNA评分均呈负相关。提示HIE患儿血清HIF-1α、miR-210水平与病情的发生、发展有密切联系。分析血清中HIF-1α、miR-210可能通过某种联系影响新生儿神经系统损伤，进而影响NBNA评分，进一步提示三者都可作为评估新生儿HIE的参考指标。

研究显示，Apgar评分是表征新生儿窒息程度的一项指标，可作为新生儿未来脑部受损、发展及预后的参考指标[14]。且有研究发现，HIE新生儿血清酶AST、LDH等水平与病情程度成正比[15]。本研究中两组胎龄、性别、出生体重比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。HIE组Apgar评分明显低于对照组。提示HIE患儿Apgar评分较低，其窒息程度相对较严重。进一步研究发现，HIE组血清AST、LDH、CK、CK-MB水平均明显高于对照组。HIE新生儿血清AST、LDH、CK、CK-MB与HIF-1α、miR-210呈正相关，与NBNA评分呈负相关。提示HIE患儿血清酶AST、LDH等水平较正常新生儿高表达，且与HIE病情程度呈正相关。Logistic回归分析结果显示，HIF-1α、CK-MB是影响新生儿HIE的危险因素，NBNA评分是新生儿HIE的保护因素。提示临床上可密切监测新生儿HIF-1α、CK-MB、NBNA评分，以便及时采取治疗措施，降低发病概率。

综上所述，HIE新生儿血清HIF-1α、miR-210水平与NBNA评分均呈负相关，三者与新生儿HIE病情发展密切相关。将NBNA评分与HIF-1α、miR-210测定联合，能更加全面地评价新生儿HIE的早期危险性及预测预后，对新指标的开发、应用具有重要的临床意义。但HIF-1α、miR-210水平影响新生儿HIE病情的具体作用机制尚不十分明确，有待进一步深入研究。