杨木屑酶解液作为碳源制备细菌纤维素的条件优化

（山东恒诚检测科技有限公司 山东 250000）

1.材料与方法

(1)菌株

木醋杆菌。菌株。山东省微生物重点实验室保藏。

(2)主要试剂

葡萄糖（北京陆桥），蛋白胨（北京陆桥），酵母粉（北京陆桥），无水磷酸氢二钠（国药集团，柠檬酸一水化合物（国药集团）。

(3)主要仪器

天平、高压蒸汽灭菌器、生物安全柜、恒温培养箱。

(4)培养基

杨木屑酶解液的预处理：将杨木屑与蒸馏水按1:20混合加入，调节pH为6，加入纤维素酶液和半纤维素酶液，混合均匀，50℃水浴条件下加热的时间5h。

种子培养基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨5，酵母粉5g，无水磷酸氢二钠0.5g，柠檬酸一水化合物0.5g。

基础发酵培养基（g/L）：葡萄糖10，杨木屑酶解液100（ml/L），蛋白胨5g，酵母粉5g，无水磷酸氢二钠2.4g，柠檬酸一水化合物1.0g，pH6。

(5)产量的测定

用镊子取出静置培养数天后培养基表面形成的细菌纤维素，在蒸馏水中小心冲洗数次，直到细菌纤维素表面的菌落和培养基洗净，然后将洗干净的细菌纤维素湿膜放入含有0.1mol/L的NaOH溶液的烧杯中，在90℃条件下水浴加热2h。然后取出细菌纤维素湿膜继续用蒸馏水冲洗数次，至中性。最后用分析天平称重。

(6)单因素法优化产酶条件

①不同接种量对发酵产量的影响

将种子液不同接种量分别接种到基础发酵培养基。30℃的恒温培养箱中培养6d，然后测定细菌纤维素的产量，筛选出最佳接种量。

②不同浓度的葡萄糖培养基对发酵产量的影响

将种子液按最佳接种量分别接种到不同浓度的葡萄糖培养基（其他成分同基础产酶培养基），其他条件保持不变。

③不同浓度的蛋白胨和酵母粉培养基对发酵产量的影响

在上述优化条件下，将种子液按最佳接种量分别接种到不同浓度的蛋白胨和酵母粉培养基上，其他条件保持不变。

④培养基的不同初始pH对发酵产量的影响

将种子液按最佳接种量分别接种到不同浓度的无水磷酸氢二钠和柠檬酸一水化合物培养基（葡萄糖、蛋白胨、酵母粉采用最佳浓度，其他成分同基础产酶培养基），并调节至不同的初始pH，其他条件保持不变。

⑤发酵温度对发酵产量的影响

选用优化后的培养基成分，在不同的温度下静置培养，其他条件保持不变。

⑥发酵时间对发酵产量的影响

选用优化后的培养基成分，在最佳发酵温度下静置培养不同的时间，然后测定细菌纤维素的产量。

2.实验结果与分析

(1)不同接种量对发酵产量的影响

在上述条件下，接种量按照体积比分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%进行接种，结果见图1，细菌纤维素的产量随着接种量的增加不断升高，当接种量达到5%时，产量趋于稳定，因此选用5%作为最佳接种量。

图1 不同接种量对细菌纤维素产量的影响

(2)不同浓度的葡萄糖培养基对发酵产量的影响

在最佳接种量的基础上进行试验，结果见图2，细菌纤维素的产量随着葡萄糖浓度的增加先增加后下降，当浓度在15g/L时，产量最高，因此选用15g/L作为最佳葡萄糖浓度。

图2 不同浓度葡萄糖对细菌纤维素产量的影响

(3)不同浓度的蛋白胨和酵母粉培养基对发酵产量的影响

在最佳接种量、最佳葡萄糖浓度的基础上进行试验，结果见图3，细菌纤维素的产量随着蛋白胨浓度的增加先增加后下降，当浓度在7.5g/L时，产量最高。

细菌纤维素的产量随着酵母粉浓度的增加先增加后下降，当浓度在7.5g/L时，产量最高，因此选用7.5g/L作为最佳酵母粉浓度。

图3 不同浓度蛋白胨和酵母粉对细菌纤维素产量的影响

(4)培养基的不同初始pH对发酵产量的影响

图4 不同初始发酵pH对细菌纤维素产量的影响

在最佳接种量、最佳葡萄糖、蛋白胨、酵母粉浓度的基础上进行试验，结果见图4，细菌纤维素的产量随着初始pH的增加先增加后下降，当pH为5.5时，产量最高，因此选用无水磷酸氢二钠2.1g，柠檬酸一水化合物1.2g，调节pH至5.5作为最佳初始发酵pH。

(5)发酵温度对发酵产量的影响

选用最佳培养基成分，在不同的温度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）下静置培养6d进行试验，结果见图5，细菌纤维素的产量随着发酵温度的增加先增加后急剧下降，发酵温度30℃时，仍然产量最高，因此30℃作为最佳发酵温度。

图5 发酵温度对细菌纤维素产量的影响

3.结论

到目前为止，细菌纤维素的合成产量一直受各种因素的影响，而优化其发酵条件是目前主要的研究方向，这对于中式生产或工业生产具有重要的借鉴意义。

本文通过单因素法，对一株木醋杆菌利用杨木屑合成细菌纤维素的发酵条件进行了优化，最终确定了葡萄糖15g/L，蛋白胨7.5g，酵母粉7.5g，无水磷酸氢二钠2.2g，柠檬酸一水化合物1.2g，pH5.5，发酵温度30℃，发酵时间5d的发酵条件，其产量较优化前调高了近1倍。