云南省宣威地区肺癌患者的炎症小体核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3基因多态性▲

吕国利 雷又鸣 李 杨 施云飞 段 晋 刘寅强 赵 炜 陈 楠

(昆明医科大学第一附属医院1 老年胸外科，2 内分泌二科，云南省昆明市 650031，电子邮箱：lvguoli2009@163.com；3 云南省肿瘤医院胸外二科，昆明市 650118)

肺癌是全球范围内发病率和致死率均极高的一种恶性肿瘤，而中国云南省宣威市肺癌的发病率及死亡率在国内乃至全球均位居前列[1]，其中该地区男性和女性的肺癌死亡率分别为全国平均水平的4倍和8倍[2]，现已证实燃煤引起的室内空气污染为该地区肺癌发生的主要诱因[3]。既往研究表明，在宣威同一地区甚至同家族中，个体患肺癌风险存在巨大差别，推测可能与某种基因多态性有关[4]。近十年来，炎症小体与肿瘤之间的关系是国内外的研究热点，其中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)与肺癌有关[5]。目前，国内暂无炎症小体NLRP3基因多态性与宣威地区肺癌的相关研究。故本研究通过TaqMan探针法对NLRP3炎症小体进行单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)分型，旨在探讨炎症小体NLRP3基因多态性与云南省宣威市居民肺癌遗传易感性的相关性，以期为该地区肺癌的早期筛查、早期干预提供可靠的指导依据，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 纳入2017年6月到2019年10月昆明医科大学第一附属医院收治的来自云南省宣威地区的80例肺癌患者(观察组)为研究对象。纳入标准：(1)均来自云南省宣威地区，并在该地区居住18年以上；(2)病理明确为肺癌；(3)采血前未接受任何放化疗或抗肿瘤治疗；(4)临床资料完整。排除标准：(1)合并如糖尿病、强直性脊柱炎及系统性红斑狼疮等与基因突变有关的疾病；(2)合并其他恶性肿瘤；(3)合并严重血液系统疾病或传染性疾病；(4)与已纳入者有血缘关系。同时选取100例健康体检者作为对照组，均来自云南省宣威地区并在该地区居住18年以上，且与已纳入者无血缘关系。本研究遵循世界医学协会赫尔辛基宣言。

1.2 资料收集 收集所有研究对象的性别、年龄、民族、职业、吸烟史、居住情况、生活习惯、燃煤使用或接触史等基本资料。无烟煤接触定义为5年内未用烟煤作为家庭燃料或生产燃料，职业接触定义为从事下井挖煤工作或煤矿工作[6]。

1.3 检测方法

1.3.1 酶联免疫吸附法：使用抗凝管采集所有研究对象清晨空腹外周静脉血约3 mL，3 500 r/min离心10 min，取上层血清。采用酶联免疫吸附法检测外周血白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18表达水平。所有操作按试剂盒说明书(赛默飞世尔科技有限公司，IL-1β、IL-18检测试剂的批号分别为BMS224-2、A35613)严格执行。

1.3.2 DNA提取：使用抗凝管采集所有研究对象清晨空腹外周静脉血约3 mL，3 500 r/min离心10 min，取上层血清。使用中科瑞泰(北京)生物科技有限公司提供的DNA提取试剂盒(RTG2402)，严格按照试剂盒标准步骤提取DNA；将样本DNA稀释至50 ng/μL，并存于-80℃冷库备用。

1.3.3 TaqMan探针法检测SNP分型：检测仪器为ABI公司QuantStudioTM6型实时荧光定量PCR 仪；通用型PCR预混液(批号：4401857)、孔板(批号：4483343)、探针(批号：4333760F)等均由ABI公司提供。rs4612666上游引物为5′-AGATGGTGGTGGTGATGGTT-3′，下游引物为5′-ACCTGCCACTGCCTCTACTC-3′。具体操作步骤：(1)每孔反应液体系为10 μL通用型PCR预混液配1 μL探针，配置时实际试剂量比理论试剂量多10%～15%，混匀预混液。(2)把预混液分装到光学96孔板中(避光环境下)，每孔11 μL，每孔加基因组DNA 11 μL。(3)加样后使用光学封板膜封板，离心(4℃，2 000 r/min)60 s，将96孔板放置于实时荧光定量PCR仪上，扩增条件为60℃ 30 s、95℃ 10 min；95℃ 15 s、 60℃ 60 s，共40个循环。采用 Chromas 软件读取结果并分析。

1.4 统计学分析 使用SPSS 21.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用t检验或t′检验；计数资料以例数或百分比表示，组间比较采用χ2检验。采用χ2检验评估基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡。采用非条件Logistic回归分析NLRP3 炎症小体基因位点rs4612666与肺癌遗传易感性的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组一般资料及血清炎症指标的比较 两组一般资料差异均无统计学意义(均P>0.05)；观察组血清IL-1β、IL-18表达水平均高于对照组(均P<0.05)。见表1。

表1 两组一般资料及血清炎症指标的比较

2.2 NLRP3 rs4612666位点基因型分布的Hardy-Weinberg平衡检验 两组NLRP3位点rs4612666基因型分布符合 Hardy-Weinberg 平衡(P>0.05) ，提示选择的样本具有群体代表性。见表2。

表2 NLRP3基因位点rs4612666 基因型分布Hardy-Weinberg 平衡检验(n)

2.3 两组rs4612666基因型和等位基因频率分布比较 两组rs4612666位点基因型分布差异有统计学意义(P<0.05)；观察组T等位基因频率高于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 两组NLRP3基因位点rs4612666基因型和等位基因频率分布的比较[n(%)]

2.4 NLRP3 rs4612666位点基因型及等位基因与肺癌易感性的相关性 采用Logistic回归模型，校正性别、年龄等因素后，结果显示TT 基因型为肺癌的易感基因型[OR(95%CI)=1.294(0.675～2.479)，P=0.015]，携带T等位基因是发生肺癌的危险因素[OR(95%CI)=1.612(1.060～2.451)，P<0.001]。

3 讨 论

目前，肿瘤相关性炎症已成为学术界公认的肿瘤第7种生物学特性，长期反复的慢性炎症是引起细胞恶变最终导致肿瘤形成的重要原因。炎症反应可破坏组织的基因稳定性，造成基因突变，激活原癌基因，从而促进肿瘤发生与发展；同时，肿瘤发生后又可加剧其生长微环境中的炎症反应[7]，造成恶性循环。本研究结果显示，观察组血清IL-1β、IL-18水平均高于对照组(P<0.05)，提示IL-1β、IL-18参与的炎症反应在肺癌的发生、发展过程发挥重要作用，有学者推测炎症小体可能在其中扮演了重要角色[8]。炎症小体是由多种蛋白参与组装形成的一种大分子复合体，在固有免疫系统中扮演重要角色。研究证实，NLRP3是在肺癌组织中主要表达的炎症小体亚型之一[9]。在感染或组织损伤早期，炎症小体对炎症反应的平衡和稳态有调节作用[10]。在微环境中各种因素的长期刺激下，炎症小体的组成蛋白如胱天蛋白酶原-1、IL-1β前体及IL-18前体等启动转录翻译；同时在外界微环境中的另一些因素刺激下， 胱天蛋白酶原-1被剪切成含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1，进一步剪切IL-1β前体、IL-18前体，使炎症因子 IL-1β、IL-18被释放[11]。大量研究结果提示，燃煤造成的空气污染很可能为云南省宣威地区肺癌高发的主要环境风险因素，该地区煤炭燃烧后可产生较高浓度的二氧化硅、多环芳烃和苯并(α)芘等致癌物，且该地区室内PM10具有较强的氧化损伤能力[12-13]，而二氧化硅晶体、多环芳烃可诱导 NLRP3 炎症小体活化[14]。此外，多环芳烃在人体内的某些代谢产物可与DNA共价形成多环芳烃-DNA，导致DNA损伤，引起基因突变，增强 NLRP3的表达，进而诱发肿瘤[15-16]。但是，在相同的暴露环境中不同个体间的患病风险差异很大，部分人罹患肺癌，而部分人却安然无恙，有学者指出这可能与个体的易感性有关[17]。

NLRP3炎症小体基因rs4612666位点位于1号染色体，T>C为第 7 号内含子变异；而碱基T突变会增强NLRP3的表达，激活被剪切成含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1，引起细胞凋亡[18]。檀润先[19]发现，NLRP3位点rs4612666 等位基因频率与胃癌的遗传易感性相关，野生碱基T的携带者更容易罹患胃癌。国外研究表明，rs4612666的T等位基因与大动脉粥样硬化引起的脑梗死及微栓子的发病风险增加相关[20]。本研究结果显示，两组rs4612666位点基因型分布比例、等位基因频率差异有统计学意义(P<0.05)，且进一步行Logistic回归分析发现TT基因型属于宣威肺癌的易感基因型(P<0.05)，T 等位基因的携带者更容易患上肺癌(P<0.05)。笔者推测，NLRP3基因位点rs4612666的突变可能是通过调节细胞凋亡而导致组织化生及肺癌的发生。

综上所述，云南省宣威地区肺癌患者的T等位基因频率高于健康人群，炎症小体NLRP3的基因多态性可能与该地区居民肺癌遗传易感性密切相关。因此，可通过基因水平筛查和外周血相关指标的监控，对携带T等位基因的群体进行重点追踪和及早干预，减少该群体的患病风险。本研究的样本量小，结果可能会产生一定偏倚，因此仍需更深入的研究予进一步证实所得结论。