双委夜蛾气味结合蛋白AdisOBP6的原核表达、抗体制备及表达谱分析

宋月芹, 宋智煜, 董钧锋, 陈庆霄, 孙会忠

(河南科技大学林学院, 河南洛阳 471023)

双委夜蛾Athetisdissimilis隶属鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)委夜蛾属Athetis，是我国重要的农业害虫，对小麦、玉米、花生、大豆和甘薯等作物造成严重损失。该害虫主要分布于中国、日本、朝鲜、印度、印度尼西亚和菲律宾等国家(Takahashi, 1975; Banetal., 1998; Choetal., 2010; 李静雯等, 2012)。双委夜蛾首次在山东威海玉米地发现为害(李静雯等, 2012)，随后在河南、陕西和安徽等地也陆续出现该虫的报道(宋月芹等, 2015; 段爱菊等, 2016; 郭婷婷等, 2016a, 2016b)。双委夜蛾幼虫和成虫在外形上与二点委夜蛾Athetislepigone极其相似，为害特征也相同，常隐蔽在秸秆、落叶和杂草中，在田间与二点委夜蛾混合发生。据统计，近6年二点委夜蛾为害面积近220万hm2，缺苗率高达70%以上，给玉米产量造成巨大损失(王振营等, 2012)，而其中可能有一部分是双委夜蛾为害的。在室内用玉米苗饲养试验发现，双委夜蛾的幼虫食量、幼虫取食期和产卵量远大于二点委夜蛾(郭婷婷等, 2016a)。在田间，农民常将双委夜蛾与二点委夜蛾混在一起防治，长期施用广谱性杀虫剂使害虫极易产生抗药性，防治效果下降，对人畜不安全还污染环境。目前国内外专家通过研究昆虫基因功能等方面，以探索新型的对害虫专一性强、对人畜安全的绿色防控技术，已经取得了一定进展，而目前双委夜蛾这方面的研究较少。

昆虫具有灵敏的嗅觉系统，可以通过嗅觉精准地定位到配偶、寄主植物以及天敌(Leal, 2013)，因此人们为了保护环境，探索新型害虫防治技术，对昆虫有关嗅觉基因开展了大量研究。如气味结合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)(Gaoetal., 2018; Zhangetal., 2019; 巩雪芳等, 2020; Wangetal., 2020)、化学感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)(Qiuetal., 2018; Alietal., 2019)、嗅觉受体(olfactory receptors, ORs)(陈丽慧等, 2019; Tiwarietal., 2019)、味觉受体(gustatory receptors, GRs)(Poudeletal., 2015; Liuetal., 2020)、离子型受体(ionotropic receptors, IRs)(Abuinetal., 2019)、感觉神经元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins, SNMPs)(胡颖颖等, 2013; Blankenburgetal., 2019)和气味降解酶(odorant degrading enzymes, ODEs)(Prestwich, 1987; Chertempsetal., 2015)等。其中OBPs是一类可溶性的小分子蛋白，在昆虫触角感器中高度表达，为气味识别的第一步(Pelosi and Maida, 1995)。根据半胱氨酸的数量，将OBPs分为5类：含有6个保守半胱氨酸位点的Classic OBPs；在第6个半胱氨酸后面多2～3个半胱氨酸残基，并且还有一个保守的脯氨酸位点的Plus-C OBPs；只有4个或5个半胱氨酸的Minus-C OBPs；具有2个典型半胱氨酸排列模式的Dimer OBPs；基因序列较长，特征不明显的Atypical OBPs(Zhangetal., 2013; McKenzieetal., 2014; Guetal., 2015)。

关于昆虫触角中OBPs的研究很多(Fanetal., 2011; Costa-da-Silvaetal., 2013; Ishidaetal., 2013; Duetal., 2019)，但对昆虫精巢中OBPs的报道很少。Li等(2008)发现埃及伊蚊AedesaegyptiOBP22蛋白在雄蛾生殖器内大量表达，并在交配过程中将该蛋白转运到雌蛾的腹部末端和受精囊中，推测该蛋白可能作为某种信息素的载体，类似于脊椎动物的尿液和唾液。Sun等(2012)研究发现OBP10蛋白在棉铃虫Helicoverpaarmigera和烟青虫H.assulta雄蛾昆虫的精液中也大量表达，交配后将该蛋白转移到雌蛾生殖器内，随着精子与卵细胞的结合传递给受精卵，推测该蛋白可能携带保护卵的防御物质十二碳烯(dodecene)，在雌雄成虫交配时传递给受精卵，避免受孕雌蛾在其附近产卵，从而减少了种群内和种群之间的自相残杀。同样，我们前期在对双委夜蛾OBPs研究时，也发现AdisOBP6在精巢中大量表达，其表达量远大于在触角中的(Sunetal., 2016)。为了进一步弄清AdisOBP6的表达规律，我们通过原核表达和抗体制备，用荧光定量PCR和Westen blot印迹方法分别对AdisOBP6在mRNA和蛋白水平上的表达情况进行分析，为今后进一步研究AdisOBP6基因的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

本研究中所用的双委夜蛾来自河南科技大学林学院昆虫实验室，该群体自2017年7月在洛阳周边玉米田诱集成虫，然后在室内继代饲养至今。室内饲养条件为：温度27±1℃，相对湿度80%±5%，光周期16L∶8D。

1.2 AdisOBP6蛋白的结构分析

首先确定模板，将AdisOBP6(GenBank登录号: ALZ45421.1)氨基酸序列提交到Meta(http:∥bioinfo.pl/meta)在线网站，寻找同源序列，同源性在30%以上的氨基酸序列就可以作为模板用于三维结构的构建；然后采用Discover Studio 2.0软件工具中的Homology模块中的Modeler程序，以已知三维结构的同源序列模板预测AdisOBP6蛋白的三维结构。为了模拟蛋白的真实性，需要将目的蛋白的信号肽去除，根据模拟3D结构的得分情况，选取得分最高的结构作为最终结构。同时将比对文件用ESPript 3.0软件进行二级结构优化(Robert and Gouet, 2014)。

1.3 总RNA的提取及cDNA第1链的合成

收集双委夜蛾羽化后第3天的雌雄成虫触角、末龄幼虫精巢(因为幼虫雌雄难辨，我们采用随机方法解剖，以观察到精巢为准)、化蛹第3天的精巢以及成虫羽化后第1, 2, 3和5天的精巢，还有未受精卵和受精卵。将双委夜蛾各部分组织解剖后立即浸在液氮中的1.5 mL离心管内，然后保存在-80℃超低温冰箱中备用。

总RNA的提取采用RNAiso Plus Kit(TaKaRa，北京)试剂盒进行，并使用RNase-free DNase I(TaKaRa，北京)对提取的RNA进行除DNA处理。采用1%的琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000c分光光度计(Thermo Scientific)进行质量检测。采用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，北京)试剂盒对RNA进行反转录合成cDNA第1链。

1.4 重组表达载体的构建

去掉AdisOBP6蛋白序列N端信号肽，在蛋白C端加入His标签和终止密码子TAA，序列经过密码子优化后，并添加NdeI/XhoI为酶切位点序列(引物中下划线序列)，由上海生工合成引物序列，AdisOBP6-NdeI-F： 5′-CCCATATGGGAGCCTGGATG AACTG-3′； AdisOBP6-XhoI-R： 5′-CCCTCGAGGGGA TGATGGTGATGATGT-3′。以1.3节合成的双委夜蛾末龄幼虫精巢cDNA为模板，用带有NdeI和XhoI酶切位点的AdisOBP6特异引物进行PCR扩增，PCR反应体系(20 μL): cDNA模板1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1.5 μL, dNTPs (2.5 μmol/L)1.6 μL,ExTaqDNA聚合酶(TaKaRa，大连)0.2 μL, 10×ExTaqbuffer 2 μL, ddH2O为12.2 μL。PCR反应条件: 94℃变性5 min; 94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 35个循环; 最后72℃延伸10 min。胶回收目的片段，将目的片段克隆到pMDTM19-T载体上，转化大肠杆菌EscherichiacoliDH5α感受态细胞，挑取阳性克隆培养过夜，提取质粒。将该质粒酶切后，用T4 DNA连接酶连接到酶切过的pET-28a(+)载体上，克隆到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂板过夜后挑去阳性克隆，摇菌提取组合后的pET-28a/AdisOBP6质粒，双酶切测序检测，挑取正确的质粒备用。

1.5 AdisOBP6重组蛋白的表达、纯化及抗原制备

取1 μL重组的pET-28a/AdisOBP6质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布在LB固体培养基(含卡那霉素)上，37℃培养过夜。挑取阳性单菌落于5 mL的LB培养基(含卡那霉素)中37℃ 220 r/min摇菌培养过夜培养。将培养的菌液按1∶100(v/v)比例接种于3 L的LB液体培养基(含卡那霉素)中，37℃ 220 r/min培养，当OD值达到0.6时，添加终浓度为0.5 mmol/L IPTG，220 r/min，20℃和37℃分别诱导过夜，离心收集细胞菌体。

将收集的菌液超生破碎，4℃ 12 000 r/min离心20 min，收集上清和沉淀，SDS-PAGE蛋白电泳检测蛋白的可溶性。采用镍琼脂糖亲和层析法纯化蛋白，用20, 50和500 mmol/L咪唑洗脱，纯化的蛋白经SDS-PAGE检测后，在1×PBS(pH 7.4)中4℃透析过夜，再用PEG20000浓缩，0.45 μm滤膜过滤后，进行SDS-PAGE电泳检测。检测合格后，分装1 mL/管，共5管，-80℃冻存，用于抗体制备。

1.6 AdisOBP6抗体的制备

初免抗原为蛋白抗原与等体积弗氏完全佐剂混匀乳化，二免、三免、终免抗原为蛋白抗原与等体积弗氏不完全佐剂混匀乳化，免疫新西兰大白兔4次。采用ELISA法检测抗体效价，将AdisOBP6抗体分别稀释后，在450 nm的波长下测OD值，血清效价值≥2.5×阴性值为合格。检测抗体为阳性后保存于-80℃备用。抗体由生工生物工程(上海)股份有限公司制备。

1.7 AdisOBP6表达谱测定

荧光定量PCR在StepOne Plus型荧光定量PCR(ABI， Foster， CA， 美国)仪器上进行操作，使用2×SG Fast qPCR Master Mix(High Rox，B639273，BBI)试剂盒测定。双委夜蛾AdisGAPDH(GenBank登录号: KT361883)基因作为内参基因。采用Primer3在线工具设计引物，AdisOBP6正向引物： 5′-AGACAGAAGACAATGCCTGACAGTG-3′；反向引物： 5′-CTGACCTCAACATCATTCACGCTT-3′。AdisGADPH正向引物： 5′-CTGCTCATTTAGAGGGTGGTGC-3′；反向引物： 5′-TCTTCTGGGTAGCGGTGGTAG-3′。 将1.3节合成的cDNA样品稀释10倍作为模板上机检测。PCR反应体系: SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL, 正反引物(10 μmol/L)各0.4 μL, cDNA模板(200 ng/μL)2 μL, 7.2 μL ddH2O补齐至20 μL。反应程序: 95℃预变性3 min; 95℃变性5 s, 60℃退火并延伸30 s, 共45个循环。熔点曲线设置为95℃持续15 s，降到60℃持续60 s，再升到95℃保持15 s。每个组织3次生物学重复，每生物学重复雌雄触角各来自50头个体、不同时期的精巢来自20头个体、受精卵和非受精卵各500粒，技术重复3次。以双委夜蛾雌成虫触角中基因表达量为对照，利用相对表达量公式2-ΔΔCt进行计算(Livak and Schmittgen, 2001)。

提取双委夜蛾羽化后第3天的雌雄成虫触角、末龄幼虫精巢、化蛹第3天的精巢以及成虫羽化后第1, 2, 3和5天的精巢，还有未受精卵和受精卵10种组织的总蛋白，每种组织重复3次。蛋白变性后，使用5%浓缩胶和15%的分离胶进行SDS-PAGE蛋白电泳。然后在200 mA电流下持续50 min，进行转膜。用含5%脱脂奶粉的TBST封闭液，室温摇床封闭2 h，一抗(AdisOBP6抗体)孵育4℃过夜，二抗37℃摇床孵育2 h。ECL显色曝光，拍照。为了检测样品蛋白情况，用小鼠单抗β-actin(预实验显示蛋白表达稳定)做一抗为对照组，进行Westen blot检测。

1.8 数据分析

数据采用SPSS 17.0(IBM, Chicago, IL, 美国)软件中的单因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey氏HSD法进行差异显著性分析，P<0.05表示样品间存在显著性差异。

2 结果

2.1 AdisOBP6的结构特征

通过结构比对得出AdisOBP6与冈比亚按蚊AnophelesgambiaeAgamOBP4结构最为相似，该结构为X衍射得到的蛋白结构，可靠性强，因此选择AgamOBP4的结构作为AdisOBP6的三维结构预测模板。比对可见，AdisOBP6具有气味结合蛋白保守的6个半胱氨酸，并具有7个α-螺旋结构(图1: A, B)，蛋白N端和C端明显可见(图1: B)，通过表面结构模拟，可见α-螺旋形成一个结合口袋，用于运输气味分子(图1: C)。

图1 双委夜蛾AdisOBP6二级结构及三级结构模拟图

2.2 原核表达载体的构建和鉴定

用带有酶切位点的引物PCR扩增重组质粒pET-28a/AdisOBP6，如图2所示，在400 bp左右的地方出现目的条带，与理论大小基本相符合。挑选pET-28a/AdisOBP6阳性转化子经质粒小提后分别用NdeI和XhoI进行双酶切鉴定，出现5 kb和400 bp左右的两个序列片段，与预测目的条带的结果相一致。

图2 pET-28a/AdisOBP6重组质粒PCR(A)和酶切鉴定(B)

2.3 AdisOBP6重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达

为了达到理想的表达效果，我们采用小样分别在20℃和37℃条件下用IPTG(0.5 mmol/L)诱导。从图3中可知，在20℃条件下，诱导效果最佳，目的蛋白表达量最高。在20℃和37℃条件下蛋白都大量表达在上清中，沉淀中很少，说明蛋白主要为可溶性蛋白。

2.4 AdisOBP6蛋白纯化

SDS-PAGE检测结果表明，在20 mmol/L咪唑洗脱时出现单一清晰的目的条带，随着咪唑浓度增加条带清晰度越来越低(图4: A)；将透析和浓缩后的纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳检测结果显示，AdisOBP6蛋白条带清晰，杂带少，说明蛋白纯化效果较好(图4: B)。

2.5 AdisOBP6抗体特异性

ELISA法测定抗体的效价，吸光值随着抗体稀释倍数的增加逐渐降低；4次重复的抗体分别稀释到512 000, 512 000, 512 000和64 000倍时，抗体效价值≥2.5×阴性值。为了鉴定所制备的AdisOBP6抗体的特异性，以Western blot法检测抗体对AdisOBP6重组蛋白的识别(图5)，结果显示，重组蛋白与AdisOBP6抗体很好地结合在一起，说明该抗体确实为AdisOBP6抗体，故所制备的抗体可用于AdisOBP6功能的相关研究。

图3 重组蛋白AdisOBP6的SDS-PAGE电泳检测

2.6 AdisOBP6基因在mRNA水平和蛋白质水平上的表达谱

荧光定量PCR结果显示，AdisOBP6在双委夜蛾精巢中的表达量远高于在触角中的，在幼虫期的精巢中AdisOBP6就已经开始表达，蛹期表达量显著低于幼虫期的(P<0.05)。成虫羽化后，AdisOBP6在精巢中的表达量逐渐进入高峰。未受精卵和受精卵中AdisOBP6几乎不表达或表达量极低(图6: A)。

Western blot检测分析发现，AdisOBP6蛋白主要在精巢中表达，在雌雄成虫触角、受精卵和未受精卵中表达量很低。在幼虫精巢中AdisOBP6蛋白就开始表达一直延续到成虫期，在成虫期精巢AdisOBP6的表达量达到高峰(图6: B)。

图4 AdisOBP6蛋白纯化(A)和浓缩后(B)的SDS-PAGE电泳检测

图5 Western blot检测抗体对重组蛋白AdisOBP6的特异性

图6 双委夜蛾AdisOBP6基因在mRNA(A)和蛋白(B)水平上的表达谱

3 讨论

目前获得蛋白三维结构的方法主要是核磁共振(NMR)和X-射线衍射等方法，昆虫多种气味结合蛋白三维结构也被解析(Sandleretal., 2000; Lartigueetal., 2002; Leeetal., 2002; Pesentietal., 2009)。从昆虫气味结合蛋白三维结构来看，OBPs包含有6个α-螺旋，并命名为α1, α2, α3α, α4α, α5和α6，其中α1和α3, α3和α6, 以及α5和α6分别连接成3个二硫键支撑蛋白结构，使蛋白结构更稳定，并且围成一个口袋形状，将亲水性氨基酸分布到口袋外面，疏水氨基酸分布在口袋内，形成疏水性口袋，主要用于结合一些亲脂性气味分子，将这些气味分子转运到受体上(Jiangetal., 2009; Xuetal., 2010)。采用同源建模的方法，特别是序列一致性较高时，能够准确预测到OBPs的三维结构，促进OBPs功能的研究。我们通过序列比对，AdisOBP6与冈比亚按蚊AgamOBP4氨基酸序列一致性最高，并进行同源建模，预测了AdisOBP6的三维结构，发现AdisOBP6具有7个α-螺旋。昆虫OBPs的构象变化具有pH依赖性(Xuetal., 2010; Tianetal., 2016)，在pH酸性条件下，氨基酸序列的C端形成第7个α-螺旋占据结合腔释放配体；pH中性时，第7个α-螺旋从结合腔排出，漏出结合腔内的疏水性残基，重新结合气味分子(Xu and Leal, 2008; Xuetal., 2010)，此现象并非所有鳞翅目OBPs共有。

原核表达蛋白纯化是直接关联着后期蛋白功能的研究，当前对原核表达可溶性His标签融合蛋白纯化最常用的方法是镍琼脂糖亲和层析法纯化蛋白。该方法容易获得高纯度的蛋白，纯化效率高，操作方便。然而在原核表达的时候经常出现包涵体，还需经过变性复性才能恢复生物活性(张庶民和祁自柏, 1995)，操作复杂。因此在原核表达时，经常降低温度，以便使蛋白尽量为可溶性蛋白。本研究采用不同温度(20℃和37℃)进行原核表达，结果表明两种温度下都能成功表达出可溶性的AdisOBP6蛋白(图3)，且在20℃时蛋白表达量更高。此研究为后期进行结合实验等蛋白功能研究奠定基础。

昆虫大多数OBPs主要表达在触角中，也有少量OBPs在头、口器、足、翅和中肠等非嗅觉器官中表达(Zhuetal., 2013; Liuetal., 2015; 巩雪芳等, 2020)，暗示它们可能还参与了除嗅觉以外其他的生理功能。例如，黑花蝇Phormiaregina的OBP56a在口器中高度表达，推测对膳食脂肪酸具有增溶作用(Ishidaetal., 2013)；埃及伊蚊的OBP45在卵巢中大量表达，可能参与卵膜的形成(Costa-da-Silvaetal., 2013)；中华蜜蜂Apisceranacerana的OBP15在足中特异性高度表达，推测可能在采集花粉和花蜜时用于味觉的识别(Duetal., 2019)。我们发现AdisOBP6基因在精巢中大量表达，并且在幼虫期AdisOBP6就已经开始表达，蛹期表达量低于幼虫期，成虫期表达量逐渐进入高峰，未受精卵和受精卵中AdisOBP6几乎不表达或表达量极低；Western blot印迹试验也证实了，AdisOBP6蛋白在精巢中大量表达，但在触角、受精卵和未受精卵中几乎没有检测到AdisOBP6蛋白的存在(图6)，推测AdisOBP6可能参与了授精过程。同样，埃及伊蚊的OBP22和棉铃虫、烟青虫的OBP10也在精液中高度表达(Lietal., 2008; Sunetal., 2012)，具体的生理功能只是推测，还需要进一步去证实。

本研究成功地纯化出AdisOBP6可溶性蛋白，并制备了相应的抗体，同时针对AdisOBP6在mRNA水平和蛋白质水平上的表达情况进行了研究，为今后研究AdisOBP6在双委夜蛾精巢内的具体生理功能奠定了基础，同时也丰富了昆虫气味结合蛋白基因功能的认识。