中华蜜蜂气味结合蛋白AcerOBP14的表达及配体结合特性分析

彭 竹, 黄 丽, 赵淑果, 吕建华, 赵慧婷

(山西农业大学生命科学学院, 山西太谷 030801)

昆虫具有灵敏的嗅觉系统，能够通过识别环境中的气味分子来进行觅食、交配、躲避敌害以及寻找栖息地等一系列行为。例如，小菜蛾Plutellaxylostella能够根据芥菜油异硫氰酸酯的含量来识别十字花科伯内特家族的成员(Verkerk and Wright, 2008)。触角是昆虫感受外界环境气味分子，嗅觉发生的主要器官。在昆虫触角外周嗅觉系统中参与化学感知过程的蛋白主要包括气味结合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)、嗅觉受体(olfactory receptors, ORs)、离子型受体(ionotropic receptors, IRs)、感觉神经元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins, SNMPs)、化学感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)和气味降解酶(odorant-degrading enzymes, ODEs)(Sánchez-Graciaetal., 2009; Leal, 2013)。其中，OBPs是昆虫嗅觉识别中的关键蛋白。昆虫OBP于1981年在雄性多音天蚕蛾Antheraeapolyphemus的触角中首次被发现(Vogt and Riddiford, 1981)，目前OBPs已在鳞翅目(Sunetal., 2017a)、鞘翅目(Lietal., 2017)、双翅目(Zhao Yetal., 2018)、膜翅目(Zhaoetal., 2016)、直翅目(Jiangetal., 2018)和半翅目(Sunetal., 2017b)等多类昆虫中鉴定获得。

OBPs是一种低分子量的水溶性球蛋白，可以通过与气味分子形成复合物穿过淋巴液，然后与嗅觉神经元树突膜上的ORs相互作用，将化学信号转变为电信号，传至中枢神经系统后，指导昆虫产生相应的行为反应(Pelosietal., 2018)。根据OBPs序列的保守性和功能可以分为3类：信息素结合蛋白(PBPs)、一般气味结合蛋白(GOBPs)和触角特异性蛋白(ASPs)(Zhou, 2010)。OBPs的构象受到pH值的影响，与神经元膜表面的邻近性有关，从而介导挥发性分子的结合和释放(Sandleretal., 2000; Wei and Leal, 2008)。一般来说，在中性环境中，OBP与配体的结合亲和力更高(Lietal., 2018)。此外，由于OBP体积小、可溶性强、稳定性好、易于操作和修饰，是更易于研究的目标(Britoetal., 2016)。多年来，研究者们致力于在体外模仿生物体的嗅觉感知能力，以期实现构建高灵敏、高特异性的嗅觉生物传感器，拓展其在环境监测、食品检测及疾病诊断等领域的应用及发展(Larisikaetal., 2015; 卢妍利, 2017)。

近年来，由于荧光竞争结合实验操作简单、便宜经济、结果稳定，被广泛应用于研究昆虫OBPs与气味物质的结合能力(彭竹等, 2020)，如小菜蛾PlutellaxylostellaOBP31(覃江梅等, 2016)、棉铃虫HelicoverpaarmigeraOBP16(李兆群等, 2017)、甘薯蚁象CylasformicariusOBP8(贾小俭等, 2019)、西方蜜蜂ApismelliferaOBP14(Iovinellaetal., 2011; Spinellietal., 2012)、稻纵卷叶螟CnaphalocrocismedinalisOBP14(Sunetal., 2019)等与化合物的结合能力。

中华蜜蜂Apisceranacerana(简称“中蜂”)是东方蜜蜂Apiscerana的指名亚种，为我国独有的蜜蜂品种，与意大利蜜蜂Apismelliferaligustica(简称“意蜂”)同是传统农业的重要传粉昆虫。中蜂具有飞行迅捷、嗅觉灵敏、抗逆性强和善于采集零星蜜粉源等优点(赵慧婷等, 2015)。目前对中华蜜蜂OBPs的研究主要集中在基因的时空表达和蛋白结构预测分析上，对其重组蛋白表达及功能的报道较少。为深入研究中蜂嗅觉基因的功能，在本课题组前期测定的中华蜜蜂触角转录组数据 (Zhaoetal., 2018)的基础上，从中筛选出了触角上特异性表达的气味结合蛋白基因AcerOBP14，并对其进行了克隆和时空表达分析(杜亚丽等, 2016)，结果显示AcerOBP14在20日龄中蜂触角中表达量最高。为进一步探究AcerOBP14 在20日龄这一阶段中蜂嗅觉感知中的功能，本研究选择了中蜂采粉蜂、意蜂采粉蜂、20日龄中蜂成年工蜂及20日龄中蜂成年雄蜂的触角样本，分析比较了OBP14在各样本中的表达量，测定了AcerOBP14重组蛋白与植物挥发物、信息素等气味化合物的结合特性。该研究不仅为OBP14在中蜂和意蜂中的功能比较奠定基础，也有助于深入解析OBPs在中蜂独特的生理行为中发挥的作用，为其在农业生产中的应用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

实验用蜜蜂均采自山西农业大学实验蜂场。选取群势强壮、健康无病、无自然分蜂倾向的蜂群，从中蜂群中分别抽出成熟封盖的工蜂子脾、雄蜂子脾置于人工培养箱恒温培养，待其羽化出房后用无味无毒的记号笔在背部进行标记(约 2 000 头)，标记后再放回原来的蜂箱， 待20日龄时采集工蜂和雄蜂(选取的中蜂雄蜂是16∶00时左右交配返回蜂巢的，此时的雄蜂处于性成熟阶段)，采集时用消毒镊轻轻夹住蜜蜂的胸部，收集至木盒中。另外，在巢门口采集后足携带花粉的中蜂采粉蜂和意蜂采粉蜂。在蜜蜂巢门口，用消毒镊轻轻夹住中蜂采粉蜂和意蜂采粉蜂胸部，收集至木盒中。每个样本需采集蜜蜂300头，随机分为3组，分离触角，每100对触角混样作为一个生物学重复。采集后的样品要迅速投入盛有液氮的研钵中，速冻并研磨至粉末状随后置于含有 1 mL Trizol 的离心管中，-80℃保存备用。

1.2 质粒、细胞与试剂

中蜂AcerOBP14重组蛋白原核表达质粒pET28a/AcerOBP14以及大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)感受态细胞均由本实验室保存。总RNA 提取试剂Trizol购自美国Invitrogen公司；cDNA 第1 链合成试剂盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)和荧光定量试剂盒SYBR PremixEx TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)购自宝生物工程(大连)有限公司；固相RNase清除剂、凝血酶和牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)购自北京索莱宝科技有限公司；His标签蛋白纯化试剂盒(包涵体蛋白)购自康为世纪生物科技有限公司；色谱级甲醇购自TEDIA 公司；1-NPN(N-苯基 -1-萘胺，N-phenyl-1-naphthylamine)购自梯希爱公司(纯度>97%)；气味标品均购自阿拉丁试剂有限公司；其他均为国产分析纯试剂。

1.3 总RNA的提取及cDNA第1链的合成

按照Trizol试剂说明书进行1.1节触角样本总 RNA 的提取，经纯度和浓度测定之后，根据反转录试剂盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)合成cDNA 第1链，反应所需 RNA 总量为 1 μg。获得的 cDNA 模板置于-20℃保存备用。

1.4 qRT-PCR测定基因表达量

以1.3节合成的4种触角样本cDNA为模板，利用在线工具 Primer3Plus(http:∥www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)设计引物序列，选择东方蜜蜂的Arp1(GenBank登录号: HM640276.1)为内参基因(正向引物序列：5′-ACTACGGCCGAACGTGAAAT-3′；反向引物序列：5′-GGAAAAGAGCCTCGGGACAA-3′)。 参考AcerOBP14(GenBank登录号: KT246482)设计扩增OBP14的引物(正向引物序列：5′-GGCTTTTGCATTTGCGT TGG-3′；反向引物序列：5′-CAATGCCAGTTTCTGT GGCG-3′)。使用 SYBR® Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)试剂盒进行qRT-PCR，反应体系(15 μL): SYBR® Premix Ex TaqTMII(2×)7.5 μL, 2×ROX Reference Dye II 0.4 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL, cDNA 模板 1.5 μL, 灭菌超纯水 4.4 μL。反应程序: 95 ℃预变性 30 s; 95℃变性 5 s, 60℃退火 30 s, 共 42个循环。熔解曲线的反应条件: 95℃ 15 s, 60℃ 1 min。以OBP14在20日龄中蜂成年工蜂触角中的表达量为基准，每个样品进行3 次技术重复。

1.5 重组蛋白的诱导表达和分离纯化

活化含重组表达载体pET28a/AcerOBP14的大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒后重新转进BL21(DE3) 感受态细胞，平板涂布后，挑取获得的单克隆菌落接种于3 mL LB 培养基(含Kan 30 μg/mL) 中，37℃ 220 r/min振荡培养过夜,活化后按1∶1 000比例(v/v)转接至10 mL LB培养基(含Kan 50 μg/mL)，振荡培养至OD600为0.8左右;取1 mL菌液作为阴性对照，再向原菌液加入IPTG至终浓度为0.5 mmol /L，转速设置为200 r/min，分别于20, 28和37℃下继续诱导，6 h后对电泳图进行分析，确定最佳诱导温度。

将200 mL 诱导后的含pET28a/AcerOBP14的菌液，12 000 r/min离心10 min，弃上清，收集至50 mL离心管中，加入20 mL裂解缓冲液充分悬浮菌体后，间断超声30 min， 4℃ 12 000 r/min离心10 min，收集上清和沉淀，确定重组蛋白的位置。沉淀经结合缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl， 5 mmol/L咪唑， 0.5 mol/L NaCl， 8 mol/L尿素)重悬后，经 0.22 μm微孔滤膜过滤，然后用镍柱纯化目的蛋白。用不同浓度(15, 30, 50, 80, 100, 300和500 mmol/L)咪唑洗脱缓冲液对镍柱进行梯度洗脱，之后经SDS-PAGE检测，将含有目的蛋白的洗脱液转移至透析袋中(截流量3.5 kD)，在Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中4℃透析24 h，期间更换新鲜的Tris-HCl缓冲液3次,用超滤凝缩管(Millipore，截留分子量为 10 kD)浓缩后，用凝血酶切除 His-tag，参照His 标签蛋白纯化说明书再次进行亲和层析蛋白纯化。将纯化后的目的蛋白分装至2 mL离心管中，置于-80℃保存。

1.6 重组蛋白浓度测定

Bradford法测定蛋白浓度，标准蛋白BSA用双蒸水稀释成7个浓度梯度(0, 24, 48, 60, 72, 84, 96和120 μg/mL)制作标准曲线。在每孔中加入1×G250考马斯亮蓝500 μL，然后将稀释好的 BSA标准品和待测品分别加入 96 孔板中，每孔 180 μL，颠倒混和数次后室温放置10 min，在酶标仪595 nm波长处测定吸光度值，重复测定3 次，根据标准曲线方程计算用于荧光竞争结合实验的重组蛋白AcerOBP14样品的蛋白浓度。

1.7 荧光竞争结合实验

本实验选取了4种信息素和23种植物挥发物。荧光分光光度计(RF-5301PC型)为日本岛津公司生产。具体步骤如下：设置荧光分光光度计激发光波长为337 nm，扫描发射波长范围360～550 nm，狭缝宽度为3 nm，灵敏度为高。在荧光比色皿中加入1-NPN和AcerOBP14蛋白的混合液(终浓度均为1 μmol/L)，静置2 min使充分反应，测定荧光强度，然后将溶于甲醇的气味标样(终浓度为1 μmol /L)依次加到荧光比色皿中，浓度从1～10 μmol/L 依次递增，静置2 min，待荧光强度稳定后，记录最大荧光值。

为了测定蛋白的结合浓度，以337 nm(最大发射光谱处)的荧光强度值对1-NPN浓度作图。Scatchard 法线性化该曲线。假设蛋白活性为100%，并且在饱和状态下，蛋白与气味化合物1∶1结合，根据气味化合物的IC50值(气味化合物替换50%探针时的浓度)，计算气味化合物的解离常数Ki(Ki=IC50/[I+(1-NPN)/K1-NPN])。计算公式中，1-NPN是未结合1-NPN浓度，K1-NPN为OBP/1-NPN复合物的解离常数。解离常数越小，表示蛋白与气味化合物的结合能力越强。

1.8 数据分析

采用 2-ΔΔCT的方法检验OBP14在不同样本间的表达差异，采用单因素ANOVA法进行方差分析，Duncan氏多重比较法分析差异显著性(P<0.01表示差异极显著)。使用GraphPad Prism 7.0软件对qRT-PCR和荧光竞争结合实验的数据进行分析和作图。

2 结果

2.1 OBP14在中蜂和意蜂不同触角样本中的表达

利用 qRT-PCR 测定了OBP14在中蜂采粉蜂、意蜂采粉蜂、20日龄中蜂成年工蜂和20日龄中蜂成年雄蜂触角中mRNA的表达量(图1)。结果显示，OBP14在4种触角样本中均有表达，但在中蜂采粉蜂触角中的表达量最高，其次为在20日龄中蜂成年工蜂、20日龄中蜂成年雄蜂中的，均显著高于在意蜂采粉蜂触角中的表达量(P<0.01)。

图1 OBP14在中蜂和意蜂不同触角样本中的表达量

2.2 AcerOBP14重组蛋白的诱导表达及纯化

重组质粒pET28a/AcerOBP14转入表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)，经 IPTG 诱导出目的蛋白。实验中确定最佳诱导温度为28℃，SDS-PAGE电泳检测目的蛋白主要以包涵体形式表达，通过尿素变性、纯化及透析复性后用凝血酶切除 His-tag 标签，对切除标签后的蛋白再次纯化，在约14 kD处出现预期的单一条带(图2: 泳道11)，条带清晰均一，可用于荧光竞争结合实验。

图2 AcerOBP14重组蛋白 SDS-PAGE 分析

2.3 AcerOBP14重组蛋白浓度

采用Bradford蛋白浓度测定法测定了去除 His-tag 标签AcerOBP14的浓度，建立标准曲线，标准曲线方程为：y=0.9916x+0.381(R2=0.9963)。经计算， 用于荧光竞争结合实验的重组蛋白样品AcerOBP14的浓度为 0.784 mg/mL。

2.4 AcerOBP14重组蛋白与气味化合物的结合能力

图3 1-NPN 与重组蛋白AcerOBP14的结合分析

通过Scachard方程对AcerOBP14与1-NPN的结合曲线进行线性化处理，计算出该蛋白与 1-NPN的解离常数为1.087 μmol/L(图3)。采用荧光竞争结合实验测定AcerOBP14重组蛋白与37种气味化合物的结合能力，结果(图4和表1)显示，AcerOBP14重组蛋白可以与测试的蜂王信息素、告警信息素、那氏信息素及多种植物挥发物结合，与植物挥发物β-罗勒烯的结合能力最强(解离常数 Ki=0.297 μmol/L)，其次是与α-法尼烯(解离常数Ki=0.654 μmol/L)，与其他气味化合物也有较强的结合能力(Ki<10 μmol/L)，与肉桂酸乙酯和香草醇几乎没有结合能力(Ki>50 μmol/L)，而与5种幼虫信息素组分(棕榈酸甲酯、油酸乙酯、亚油酸甲酯、亚油酸乙酯和亚麻酸甲酯)没有结合能力。

图4 部分候选配体与1-NPN 和重组蛋白AcerOBP14的竞争结合

3 讨论

本研究结果显示，OBP14 mRNA在中蜂采粉蜂触角中的表达量极显著高于意大利蜜蜂采粉蜂触角中的，推测OBP14在中蜂的嗅觉行为中发挥着更重要作用，但由于目前尚缺乏中蜂和意蜂触角中的其他气味结合蛋白时空表达特性的比较研究，因此有关中蜂较意蜂嗅觉更灵敏的这一认识仍有待进一步证实。20日龄成年工蜂，除承担巢内工作外，还从事采粉、采蜜、采水、采胶、守卫等巢外工作(Graham, 2015)。本实验结果显示中蜂采粉蜂触角中OBP14 mRNA表达量极显著高于20日龄中蜂成年工蜂触角中的表达量，暗示AcerOBP14主要在识别花香气味上发挥作用，尤其在花粉采集上具有重要作用。AcerOBP14基因在20日龄中蜂成年雄蜂触角中也有表达，但极显著低于在中蜂采粉蜂和20日龄中蜂成年工蜂触角中的表达量(图1)，进一步推测AcerOBP14可能主要参与调控中蜂的采集行为，另外在雄蜂性信息素感知过程中也发挥作用。

表1 候选气味化合物与 1-NPN竞争结合重组蛋白AcerOBP14的结合特性

通过对AcerOBP14体外原核表达，发现重组蛋白主要以包涵体的形式存在，形成包涵体可能与pET28a 表达载体本身高表达性质有关。因为，一方面蛋白表达量越高越容易形成包涵体，蛋白合成的速度太快，没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确地配对(吉挺等, 2014)；另一方面，原核表达系统中缺失促使蛋白正确折叠的各种影响因子(程小娟等, 2016)。实验得到的包涵体需要经过纯化、变性、复性后才能具有生理活性，目的蛋白才能用于后续功能的研究。

荧光竞争结合实验已应用于棉铃虫Helicoverpaarmigera、铜绿丽金龟Anomalacorpulenta、绿盲蝽Apolyguslucorμm、小菜蛾Plutellaxylostella、斑翅果蝇Drosophilasuzukii等多种昆虫气味结合蛋白的结合特性分析(程小娟等, 2016; 李都等, 2019; 彭竹等, 2020)。本研究的荧光竞争结合实验结果表明， AcerOBP14能够与蜂王信息素、告警信息素、那氏信息素以及植物挥发物等多种气味化合物结合(表1)，表明一个基因可能调控昆虫对多种挥发物的识别(Sunetal., 2019)。在测试的气味化合物中，与AcerOBP14结合能力最强的是植物挥发物β-罗勒烯，其次是α-法尼烯。结合qRT-PCR分析结果，我们推测AcerOBP14在中华蜜蜂识别植物气味的过程中，即在其外出采集过程中发挥着重要作用。植物挥发物β-罗勒烯是兰科石斛花朵中的重要成分，石斛花为虫媒花，其花香在蜂蝶类授粉中发挥着重要的作用，另外β-罗勒烯作为植物挥发物对采集蜂的采粉行为有直接影响(Maetal., 2015; 张智博等, 2018; 王元成等, 2020)。近年来，研究人员还发现β-罗勒烯也是一种蜜蜂幼虫信息素组分，能够抑制蜜蜂工蜂的卵巢成熟，并且参与调节工蜂的采粉行为，提高采粉蜂的比例，增加哺育蜂访问巢房的频率(何旭江等, 2016; 张智博等, 2018)。He等(2016)还发现饥饿的蜜蜂幼虫通过增加β-罗勒烯的产量向工蜂发出信号，故工蜂可以通过识别这一信息素信号来调节群内的食物分配。本研究结果表明，AcerOBP14与β-罗勒烯的结合能力极强，因此推测其可能具有参与工蜂的采粉及监控群内幼虫进食等行为。AcerOBP14与大部分幼虫信息素不能有效结合，这可能与气味结合蛋白选择性绑定气味分子这一生理功能相符(颜伟玉等, 2009; Manoharanetal., 2013)。Spinelli等(2012)研究了意大利蜜蜂OBP14的气味化合物结合特性，结果表明，AmelOBP14与丁香酚、柠檬腈的结合能力最强，在同其他气味化合物的结合能力的强弱上，与AcerOBP14 也有差异，可以看出中蜂和意蜂在结合特性上差异较大(Iovinellaetal., 2011; Spinellietal., 2012)，推测OBP14的功能可能存在较大的种间差异。今后可以通过免疫印迹、触角电位(electroantennogram, EAG)、行为学反应和RNAi等实验进一步比较、确证两蜂种OBP14的功能。

本研究qRT-PCR结果表明，气味结合蛋白OBP14基因在中蜂采粉蜂触角中的相对表达量高于意蜂采粉蜂及中蜂20日龄成年工蜂和雄蜂触角中的表达量。荧光竞争结合实验结果显示AcerOBP14的配体结合谱较宽，能与蜂王信息素、告警信息素、那氏信息素及多种植物挥发物结合，其中结合能力最强的是β-罗勒烯，暗示AcerOBP14较大程度上参与和调控了中华蜜蜂的采粉行为。