两种表面活性剂对玫烟色棒束孢PF904菌株侵染小菜蛾幼虫的影响

王宏民, 赵义涛, 郭 恒, 张仙红,*

(1. 山西农业大学农业经济管理学院, 山西太谷 030801; 2. 山西农业大学植物保护学院, 山西太谷 030801)

小菜蛾Plutellaxylostella为十字花科蔬菜的主要害虫，是目前农业害虫中交互抗药谱最广、抗性水平最高、抗性发展速度最快的害虫之一。因此，应用新型生物农药防治小菜蛾已成为必然的趋势。虫生真菌是一类重要的昆虫病原微生物，在持续控制害虫、保护生态平衡方面发挥着重要作用。玫烟色棒束孢Isariafumosoroseus作为一种重要的虫生真菌，能寄生鳞翅目、鞘翅目和膜翅目等8目的多种有害昆虫(Zimmermann, 2008)。但由于其杀虫速度缓慢、防效不稳定等因素，严重制约了其在害虫防治中的应用。虫生真菌孢子在昆虫体表的成功附着和萌发是其侵染害虫的关键，但由于孢子悬浮液润湿性和分散性差，直接喷施于靶标植物和害虫时，在植物和虫体表面的附着率低，从而导致虫生真菌侵染率降低、杀虫速度下降。因此如何提高真菌孢子在植物表面的稳定持留量及虫体体表的附着率是提高虫生真菌防治效率的关键。

表面活性剂是杀虫剂中除载体之外的最重要的一类助剂(姜虹等, 2020)，它可通过降低药液的表面张力和接触角(Wirthetal., 1991; 顾中言等, 2006)，提高杀虫剂在靶标植物上的稳定持留量，从而提高其有效利用率(朱金文等, 2004; 阎世江等, 2017)，目前在化学杀虫剂的生产中得到了广泛的应用。据施辰子等(2009)报道，井冈霉素、杀虫单等可溶性粉剂及井冈·蜡芽菌、甲维·毒死蜱等复配农药中添加高活性9708表面活性剂，显著减少农药流失，防虫效果提高12%～26%；啶菌噁唑中添加烷基酚聚氧乙烯醚(NP-7)和辛基苯基聚氧乙烯醚(Triton X-100)等表面活性剂显著提高了其防效(刘鹏飞等, 2010)；高效氯氟氰菊酯中加入有机硅表面活性剂，显著提高了对螺旋粉虱Aleurodicusdispersus的防治效果，毒效比达6.07(黄超福等, 2010)；有机硅表面活性剂Silwet 618可使啶虫脒防治蚜虫的增效作用提高210.2倍(李北兴等, 2017)；咪草烟中添加有机硅表面活性剂Silwet L-77可显著提高其毒力(Reddy and Singh, 1992; Singh and Singh, 2008)。可见，表面活性剂有效提高了化学农药的利用效率，但表面活性剂是否会提高虫生真菌对靶标害虫的防效目前还未见报道。

我们的前期研究表明，添加125 mg/L的聚二甲基硅氧烷(OFX-0193)和250 mg/L的二异丁基萘磺酸钠(Nekal)表面活性剂后明显提高了玫烟色棒束孢Isariafumosoroseus在小菜蛾寄主植物叶片上的稳定持留量，并对真菌孢子的活性无影响(赵义涛等, 2020)。那么添加表面活性剂是否也会改善玫烟色棒束孢孢子在小菜蛾幼虫体表的附着量，提高其防治效果?为此，本研究采用扫描电镜，观察了添加OFX-0193和Nekal这两种表面活性剂后玫烟色棒束孢孢子悬浮液在小菜蛾幼虫体表不同部位的孢子附着量、孢子的萌发速率及侵染过程，从而为提高虫生真菌的有效利用率提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

供试虫源为山西农业大学昆虫重点实验室人工气候箱利用甘蓝叶片饲养多代的小菜蛾，饲养条件：温度26±1℃，相对湿度75%～80%，光周期14L∶10D。取个体大小一致、健康的3龄幼虫供试。

1.2 孢子悬浮液的制备

将4℃下贮存的玫烟色棒束孢PF904菌株在室温下活化1 d，接种到PDA培养基上培养10 d后，用接菌针把孢子慢慢刮下，用清水反复冲洗，涡旋振荡器打散15 min，两层纱布过滤菌丝，制成浓度为2×107孢子/mL的孢子悬浮液。将前期筛选出的表面活性剂OFX-0193和Nekal添加到玫烟色棒束孢PF904菌株孢子悬浮液中，分别配制为含OFX-0193(终浓度125 mg/L)和Nekal(终浓度250 mg/L)的2种孢子悬浮液(2×107孢子/mL)；以添加清水的孢子悬浮液(2×107孢子/mL)为对照。

1.3 供试药液侵染的小菜蛾幼虫感病症状观察

采用坡塔喷雾器将1.2节制备的供试菌液及对照分别喷施于小菜蛾3龄幼虫体表，接菌后在26±1℃和相对湿度75%±5%条件下饲养，定时更换新鲜甘蓝叶片。每处理3次重复，每重复20头幼虫。接菌后每12 h观察1次小菜蛾幼虫的感病症状。

1.4 小菜蛾幼虫体表孢子附着及萌发情况的扫描电镜观察

小菜蛾3龄幼虫的接菌及饲养方法同1.3节，接菌3 h后取样一次，分别在小菜蛾幼虫体表各结构区随机选取(1×1) mm2统计孢子数量，每个区域重复5次，并计算平均值，统计小菜蛾幼虫体表不同部位的玫烟色棒束孢PF904孢子附着量。

此后每12 h取样1次，观察小菜蛾幼虫体表不同部位玫烟色棒束孢PF904孢子萌发情况。样品用2.5%的戊二醛-磷酸缓冲液固定，放入4℃的冰箱过夜，依次用70%, 80%, 85%, 90%和95%的乙醇溶液对其进行梯度脱水，每次脱水15 min，各浓度重复脱水3次，用100%的乙醇脱水2次，每次15 min，最后用丙酮置换30 min，系列处理后，将干燥后的小菜蛾幼虫用双面导电胶固定在扫描电镜的样品台上，日立E-1010离子溅射仪喷金镀膜，在扫描电镜(S-4800；日本日立公司)下拍照观察。

1.5 添加不同表面活性剂的孢子悬浮液对小菜蛾致病力的测定

挑选个体大小、活力一致的小菜蛾3龄幼虫，采用坡塔喷雾器将1.2节配制的添加表面活性剂OFX-0193(125 mg/L)和Nekal(250 mg/L)的玫烟色棒束孢PF904孢子悬浮液和对照分别喷施于小菜蛾幼虫体表，置于皿底垫有湿润滤纸片的直径9 cm的培养皿中，于26±1℃和75%～80%相对湿度下进行饲养，并用吸足标准十字花科营养液的棉球包裹甘蓝叶片的叶柄。每处理20头幼虫，重复5次。接菌后每12 h观察1次，记录虫体感病症状和死亡虫数，计算死亡率、化蛹率和致死中时(LT50)，收集的死虫(证明幼虫是被玫烟色棒束孢菌丝致病而死)置于灭菌培养皿内，25℃保湿培养，未感病的幼虫(用于观察对照组与处理组中的畸形蛹)饲养至羽化为止。

1.6 数据分析

利用Adobe Photoshop CS6处理图片，使用DPS7.05软件进行数据统计分析，差异显著性检验用LSD法，显著性水平设定为P<0.05。

2 结果

2.1 小菜蛾3龄幼虫感染添加表面活性剂的玫烟色棒束孢PF904菌株后的感病症状

图1 小菜蛾3龄幼虫感染玫烟色棒束孢PF904菌株不同时期的外部症状

以添加125 mg/L OFX-0193和250 mg/L Nekal表面活性剂的玫烟色棒束孢PF904孢子悬浮液处理小菜蛾幼虫后，虫体的感病症状如图1所示。在染病初期，虫体的外部形态、取食和对外界刺激的反应等均与未感病幼虫无差别。接菌12 h，对照组虫体体表未见黑斑(图1: A)，而处理组虫体体表局部出现针孔般大小的黑斑(图1: D)；接菌24 h，对照组中虫体体表出现少量黑斑(图1: B)，而处理组黑斑明显增多，且部分虫体头部向上翘起，身体产生不正常的抽搐行为(图1: E)；接菌36 h，处理组感病幼虫体色为黄褐色，虫体呈油浸状，幼虫取食明显减少或停止取食，对外界刺激反应明显迟钝，腹侧的黑化斑点全面扩散(图1: G)；接菌72 h，处理组部分虫体发生皱缩(图1: H)，少数感病虫体濒临死亡，部分虫体化蛹时间提前，且多数为畸形蛹(图1: F)，化蛹后很快死亡。接菌96-144 h后，死亡虫尸僵化，体表被粉白色气生菌丝覆盖(图1: I)。

2.2 表面活性剂对小菜蛾3龄幼虫体表不同结构区玫烟色棒束孢PF904孢子附着量的影响

以添加125 mg/L OFX-0193和250 mg/L Nekal表面活性剂的玫烟色棒束孢PF904孢子悬浮液接菌到小菜蛾幼虫体表后，孢子在小菜蛾幼虫体表不同部位的附着量如表1所示。添加Nekal(250 mg/L)和OFX-0193(125 mg/L)的孢子悬浮液，其孢子在小菜蛾幼虫体表刺状突起结构区(图2: D, G)的附着量分别为12.5和9.4个/mm2，在平缓结构区(图2: E, H)的附着量分别为16.2和12.4个/mm2，在嵴状突起结构区(图2: F, I)的附着量分别为30.1和24.8个/mm2；2种处理在小菜蛾幼虫体表不同结构区的孢子附着量均显著高于对照(图2: A-C)，其中添加Nekal(250 mg/L)效果最佳，在小菜蛾幼虫体表3种部位的孢子附着量分别为对照的2.19, 1.78和1.94倍，可见，供试的2种表面活性剂可显著提高玫烟色棒束孢在小菜蛾幼虫体表的孢子附着量。

2.3 表面活性剂对玫烟色棒束孢PF904菌株在小菜蛾3龄幼虫体表不同结构区萌发和侵入的影响

玫烟色棒束孢对小菜蛾幼虫体壁的侵染需经过分生孢子附着、萌发、产生芽管和附着胞及穿透体壁等过程(陈巍巍和冯明光, 1999)。扫描电镜观察显示，以添加125 mg/L OFX-0193和250 mg/L Nekal表面活性剂的玫烟色棒束孢PF904孢子悬浮液接菌12 h后，大量的分生孢子成功附着于幼虫体表，部分孢子萌发并形成芽管(图3: D, G)，而对照中的分生孢子未萌发(图3: A)；接菌24 h后，对照中分生孢子开始萌发并形成芽管(图3: B)，而添加表面活性剂的处理组中芽管出现膨大结构形成附着胞，部分孢子向双向萌发后侵入幼虫体腔(图3: E, H)；接菌36 h后，添加表面活性剂明显促进了菌丝的生长，处理组(图3: F, I)菌丝长度显著大于对照组的(图3: C)； 接菌48 h后，虫体表面附着大量萌发的菌丝。

表1 添加表面活性剂的玫烟色棒束孢PF904菌株在小菜蛾3龄幼虫体表不同结构区的孢子附着量

图2 添加表面活性剂的玫烟色棒束孢PF904菌株在小菜蛾3龄幼虫体表不同结构区的孢子附着量

图3 添加表面活性剂的玫烟色棒束孢PF904菌株侵染不同时间在小菜蛾3龄幼虫体表不同结构区的萌发和入侵过程

2.4 表面活性剂对玫烟色棒束孢PF904菌株对小菜蛾3龄幼虫致病力的影响

由表2可知，添加不同表面活性剂后玫烟色棒束孢PF904菌株对小菜蛾幼虫的毒力及致病速率存在显著差异。添加Nekal(250 mg/L)和OFX-0193(125 mg/L)的玫烟色棒束孢PF904孢子悬浮液比对照对小菜蛾3龄幼虫的致病速率显著提高，处理组幼虫24 h后体表出现明显的感病症状，72 h出现死亡高峰， Nekal(250 mg/L)处理组中的致死中时为2.71 d，OFX-0193(125 mg/L)处理组中的致死中时为2.95 d；而对照组在36 h后出现感病症状，96 h出现死亡高峰，致死中时为4.10 d(表2)。添加不同表面活性剂的玫烟色棒束孢PF904使小菜蛾幼虫的校正死亡率和化蛹率存在显著差异(P<0.05)，Nekal(250 mg/L)处理组中小菜蛾幼虫的校正死亡率可达79.2%，化蛹率为19.6%，且12.4%为畸形蛹；OFX-0193(125 mg/L)处理组中幼虫的校正死亡率为65.7%，化蛹率为23.6%，可见玫烟色棒束孢PF904孢子悬浮液中添加这2种表面活性剂均可提高其致病力。

表2 添加不同表面活性剂的玫烟色棒束孢PF904菌株对小菜蛾3龄幼虫的致病力

3 讨论

表面活性剂可通过改善农药药液在靶标上的分布、附着、渗透等，降低药液的表面张力，促进药液在靶标表面的润湿展布和沉积量，从而提高农药的利用率(Taylor, 2011; Xuetal., 2011)。玫烟色棒束孢侵染靶标害虫，需经过孢子附着-萌发-穿透体壁才能有效侵染害虫，因此体壁上孢子的附着数量及萌发率是影响其致病力的主要因素。但由于昆虫体壁为疏水性，水溶性的孢子悬浮液喷施后常易滚落而使虫体表面孢子附着量减少。本研究结果表明，添加250 mg/L Nekal和125 mg/L OFX-0193表面活性剂的玫烟棒束孢PF904菌株在小菜蛾幼虫体表不同部位的孢子附着量为对照的1.36～2.19倍(图2)。可见，供试的2种表面活性剂可显著提高虫生真菌玫烟色棒束孢孢子在小菜蛾幼虫体表的附着量。

据赵义涛等(2020)报道，离体条件下，添加表面活性剂OFX-0193和Nekal对玫烟色棒束孢孢子的萌发有一定的促进作用。本研究表明，以添加表面活性剂125 mg/L OFX-0193和250 mg/L Nekal的玫烟色棒束孢孢子悬浮液处理小菜蛾3龄幼虫后，虫体表面出现黑斑的时间均比对照组显著提前，且其他感病症状也明显早于对照(图1)。此外，室内生测试验表明，添加表面活性剂OFX-0193和Nekal的处理组比对照对小菜蛾3龄幼虫的致死中时缩短了1.39～1.51 d(表2)。这可能由于添加表面活性剂一方面提高了小菜蛾幼虫体表的孢子附着量，同时也促进了孢子的萌发，因此显著提高了玫烟色棒束孢对小菜蛾幼虫的侵染速率。

据邱占奎等(2006)报道，10%吡虫啉可湿性粉剂添加0.05%～0.1%表面活性剂Silwet408显著提高了小麦蚜虫的防治效果；单提升等(2019)研究表明，添加表面活性剂Greenwet 7618后，四氯虫酰胺50%的推荐用量对菜青虫仍有很好的防治效果。本研究表明，添加250 mg/L Nekal和125 mg/L OFX-0193表面活性剂后，玫烟色棒束孢对小菜蛾3龄幼虫的致死率均显著高于对照(表2)。这与王静和朱九生(2016)报道的添加表面活性剂Silwet 408和Silwet 312对阿维菌素防治小菜蛾具有增效作用及封云涛等(2017) 报道的甲氨基阿维菌素苯甲酸盐微乳剂(ME)中加入有机硅表面活性剂Silwet 408可显著提高其对小菜蛾防治效果的研究结果相一致。