苯并［a］芘致小鼠认知功能障碍中突触相关蛋白和EphA/EphrinA5的变化

山西医科大学公共卫生学院环境卫生学教研室，山西 太原 030001

苯并［a］芘（benzo［a］pyrene，BaP）是广泛存在的一类环境污染物，主要来源于化石燃料和有机物的不完全燃烧［1］。除“三致”作用外，BaP 可通过血-脑屏障及嗅神经进入脑组织，损害中枢神经系统，引起认知障碍［2-3］，但作用机制尚不十分清楚。

认知功能与突触结构可塑性密切相关［4］。突触前膜的突触素（synaptophysin，SYP）和突触后膜的突触后致密物质95（post-synaptic dense protein-95，PSD95）在维持突触结构，参与突触囊泡的转运和释放，调控突触后膜稳定性及突触可塑性中起关键作用［5］。促红细胞生成素产生肝细胞受体（erythropoietin-producing hepatocyte receptors，Ephs）是目前已知最大的受体酪氨酸激酶（receptors protein tyrosine kinase，RTK）家族中重要的成员之一［6］，分为EphA和EphB两类。EphA受体通过与邻近细胞膜上的Ephrin配体结合进行双向信号转导，调控神经元轴突的定向延伸，调节突触结构，改变突触效能和神经元发生，进而影响学习记忆功能［7］。本研究探讨在BaP 致小鼠认知障碍中突触相关蛋白和EphA及其配体蛋白表达的改变，为BaP神经毒性的研究提供科学依据。

1 对象与方法

1.1 主要试剂和仪器

BaP（纯度＞97%，Sigma，美国），EphA4 抗体（货号：21875-1-AP，BBI Life Science，中国），SYP（货号：D198927，BBI Life Science，中国），BCA 法蛋白质浓度测定试剂盒、SDS-PAGE 变性丙烯酰胺凝胶快速制备试剂盒（BBI Life Science，中国），EphrinA5 抗体（货号：SC-81945，Satan，中国），EphA5 抗体（货号：A14238，ABclone，中国），PSD95 抗体（货号：20666-1-AP，Proteintench，中国），β-actin 抗体（货号：BM0627，Boster，中国）、超敏ECL化学发光即用型底物（Boster，中国）。化学发光成像仪（Boygene Chemilmage Software，中国）。

1.2 实验动物饲养及染毒

40 只SPF 级健康成年雄性ICR 小鼠（8 周龄，体重18～22 g）购买于北京兴旺养殖场，许可证号：SCXK（京）2014-0013，在动物房（自然节律采光，室温为18～23℃，湿度为40%～70%）适应性喂养1 周后，随机分成4 组，每组10 只，分别为溶剂对照组（植物油）和BaP 低、中、高剂量染毒组。小鼠腹腔注射BaP的最低致死剂量为500 mg·kg-1，按照最低致死剂量的1/1 000、1/250 和1/50，设置染毒剂量为0.5、2 和10 mg·kg-1，染毒体积为2.5 mL·g-1，隔天1 次，共染毒30 次，持续60 d。对照组注射等体积植物油。相应进入小鼠体内BaP 的量分别为1.5、6 和30 mg·kg-1，折算成人体剂量分别为15、60 和300 μg·kg-1（除以不确定系数100）。该剂量范围恰好涵盖了职业人群通过呼吸道接触BaP的量（约61.2 μg·kg-1·年-1）。

染毒期间，每天观察小鼠的神经系统症状，记录其饮水量、饮食量，每周称量体重。染毒结束第2 天采用旷场实验对小鼠的空间学习记忆能力和探索能力进行检测。动物的所有操作和处理均严格遵循山西医科大学和国家有关实验动物管理和使用的有关规定，本研究已获斯贝福（北京）生物技术有限公司实验动物伦理委员会审批（编号：2020/10/8）。

1.3 旷场实验

旷场实验采用40 cm×40 cm×40 cm 的木制实验箱，设置中心大小为25 cm×25 cm，在安静的环境下进行实验，抓取动物时动作轻柔，将动物放入箱内，同时进行摄像和计时（5 min），利用图像分析采集系统（Smart v3.0）记录小鼠的运动轨迹。观察指标有中心区停留时间和站立次数。

1.4 Western blotting法检测蛋白表达水平

行为学实验结束后的第2 天，将小鼠用水合氯醛麻醉，颈椎脱臼处死，并立即分离大脑皮质，-80℃冻存。称取30 mg 大脑皮质加入RIPA 裂解液，冰浴上超声波破碎组织，室温放置30 min 后，经4℃、12 000×g离心15 min，取上清液蛋白定量、变性。经10%的SDSPAGE变性丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移蛋白至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，EphA4（1∶1 000）、EphA5（1∶1 000）、EphrinA5（1∶50）、PSD95（1∶1 000）、SYP（1∶1 000）和β-actin（1∶2 000）等一抗孵育过夜，PBST 漂洗3 次后，二抗室温孵育40 min，PBST 漂洗3 次，超敏ECL 发光检测系统检测EphA4、EphA5、EphrinA5、SYP、PSD95 和内参β-actin 的蛋白表达水平，Boygene Chemilmage Software 凝胶成像仪拍照，并利用Image J 1.8.0 软件分析结果。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 一般情况

随着染毒剂量的增加和时间的延长，与溶剂对照组相比，0.5 mg·kg-1BaP 组小鼠进食和饮水量接近，而2 mg·kg-1和10 mg·kg-1BaP 组小鼠进食和饮水量逐渐减少，以10 mg·kg-1BaP 组减少较为明显。与溶剂对照组相比，0.5 mg·kg-1BaP 和2 mg·kg-1BaP 组小鼠有中枢神经功能轻度兴奋的表现，主要为易激惹，好斗、打架次数明显增多，而10 mg·kg-1BaP 组小鼠明显受抑制，出现精神萎靡、情绪低落、活动减少、反应迟钝，毛发光泽度降低、干枯易脱落等现象。

2.2 体重变化

染毒结束后，各染毒组小鼠体重增重呈剂量依赖性降低。与溶剂对照组相比，10 mg·kg-1BaP 组小鼠平均体重增重减少5.78 g（P＜0.05）；与0.5 mg·kg-1BaP组相比，2、10 mg·kg-1BaP 组小鼠体重增重依次降低4.43 g、7.54 g（P＜0.05）。见表1。

表1 小鼠染毒前后体重变化（±s，g）（n=10）Table 1 Changes in body weight of mice before and after exposure (±s,g)(n=10)

表1 小鼠染毒前后体重变化（±s，g）（n=10）Table 1 Changes in body weight of mice before and after exposure (±s,g)(n=10)

［注］*：与溶剂对照组比较，P＜0.05，#：与0.5 mg·kg-1 BaP组比较，P＜0.05。

组别 染毒前 染毒后 体重增重溶剂对照组 26.82±2.33 41.92±3.38 14.23±2.07 0.5 mg·kg-1 BaP 27.57±2.03 42.87±5.41 15.99±4.78 2 mg·kg-1 BaP 26.75±1.78 37.72±3.73# 11.56±4.12#10 mg·kg-1 BaP 27.49±1.23 35.37±2.62*# 8.45±2.18*#F 0.530 8.120 8.854 P 0.667＜0.001 0.001

2.3 旷场实验结果

与溶剂对照组比较，10 mg·kg-1BaP 组的小鼠在中心区停留的平均时间延长了34.42 s，而后肢站立次数减少了21.57 次（P＜0.05）。见图1。

图1 BaP 染毒对小鼠空间探索能力的影响（n=10）Figure 1 The effects of BaP exposure on the spatial exploration ability of mice (n=10)

2.4 皮质SYP、PSD95蛋白表达水平

随着BaP 染毒剂量的增加，小鼠大脑皮质SYP和PSD95 蛋白表达量降低。与溶剂对照组比较，2、10 mg·kg-1组SYP 蛋白表达量分别降低19.9%和32.2%（P＜0.05）；10 mg·kg-1组SYP 蛋白表达量较0.5 mg·kg-1组下降23.8%，较2 mg·kg-1下降12.3%（P＜0.05）。与溶剂对照组比较，0.5、2、10 mg·kg-1BaP 组PSD95 蛋白表达量分别降低8.4%、23.7%、34.8%（P＜0.05）；与0.5 mg·kg-1比较，2、10 mg·kg-1BaP 组PSD95 蛋白表达量降低15.3%、26.4%（P＜0.05）。见图2。

图2 BaP 染毒小鼠大脑皮质PSD95、SYP 蛋白表达（n=10）Figure 2 Expressions of PSD95 and SYP proteins in cerebral cortex of mice exposed to BaP (n=10)

2.5 EphA/EphrinA家族相关蛋白表达水平

与相应的溶剂对照组比较，2、10 mg·kg-1BaP 染毒组小鼠皮质EphA4 蛋白表达水平分别升高47.1%、41.3%，2、10 mg·kg-1BaP染毒组小鼠皮质EphA5蛋白表达水平分别升高31.0%、40.0%（均P＜0.05），10 mg·kg-1BaP染毒组EphrinA5蛋白表达水平下降14.9%（P＜0.05）。见图3。

图3 BaP染毒小鼠大脑皮质EphA4、EphA5 和EphrinA5蛋白表达（n=10）Figure 3 Expressions of EphA4，EphA5，and EphrinA5 in the cerebral cortex of mice exposed to BaP (n=10)

3 讨论

BaP 具有神经毒性，可引起职业人群和啮齿类动物的认知功能下降和自主神经功能紊乱［8-9］。本研究旷场实验以及前期水迷宫研究结果［10］显示，BaP 染毒可引起小鼠学习记忆能力下降，与已有研究结果一致［11-12］。蛋白印迹结果表明，大脑皮质突触相关蛋白SYP、PSD95 的表达逐渐降低，EphA4 和EphA5 表达升高，EphrinA5 表达降低，提示突触相关蛋白和EphA/EphrinA 可能在BaP 致小鼠认知功能障碍中起重要作用，这为BaP神经毒性的研究提供了新的科学依据。

认知功能与神经突触的可塑性相关［13］。突触连接是学习记忆的关键部位［14］，由突触前膜、突触后膜和突触间隙组成。位于突触前膜的SYP 是突触前膜的一种糖蛋白，与囊泡释放、突触可塑性密切相关［15-16］。PSD95是位于突触后致密区的支架蛋白，能接受突触信号并传递到突触后膜上，在突触重塑、介导及整合突触信号传递等方面发挥重要作用［17］。SYP 与PSD95在突触连接中起到了上下贯通的“桥梁”作用，常常作为反映突触传递效能和突触重建的特异性标志物［18］。本研究结果表明，BaP 染毒小鼠大脑皮质SYP、PSD95蛋白表达量降低。研究发现在阿尔茨海默病小鼠学习记忆能力下降模型中，神经突触密度减少，伴有SYP蛋白表达减少［19］，增加SYP 和PSD95 表达可提高突触可塑性，改善认知功能。PSD95 参与新突触的形成，PSD95 的表达降低，能调控LTP，导致大鼠轻度认知功能损伤［20］。未见SYP、PSD95 与BaP 的相关报道，但有文献表明，BaP 可引起大鼠海马突触结构异常和突触相关蛋白-25 堆积［21］。老年痴呆患者外周血中突触相关蛋白-25 含量与大脑突触结构受损和认知功能下降有关［22］。以上结果提示BaP 染毒小鼠大脑的突触囊泡转运能力减弱，突触后致密物变薄，进而影响神经信息的储存、加工和传递，这可能是BaP 引起小鼠认知功能障碍的作用机制之一。

Eph 家族蛋白包括Eph 受体与Ephrin 配体，主要在中枢神经系统中表达，以受体配体结合的方式，双向调节突触信号传递与神经元形态发生，参与学习记忆等神经功能［23-24］。目前报道最多的受体是EphA4和EphA5，EphA4 主要与神经系统的损伤和病变有关，EphA4 激活或缺失能影响轴突出芽、树突棘的收缩，使树突棘形态结构改变［25-26］，EphA4基因敲除小鼠出现短期空间记忆受损［27］。EphA5 主要参与树突棘的形成，EphA5基因敲除小鼠大脑皮层会出现树突棘形态异常且神经元异常聚集［28］。Gerlai 等［29］发现使用EphA5受体拮抗剂/激动剂能够损害/改善小鼠空间记忆。EphA4/A5均能与EphrinA5配体结合，激活N-甲基-D-天冬氨酸受体与PSD95 在突触表面形成复合体，促进小鼠树突棘成熟［30］。尚未见BaP 与EphA 蛋白异常的相关研究报道。本研究发现，随着BaP染毒剂量的升高，小鼠EphA4、EphA5受体蛋白表达量增加，EphrinA5配体蛋白表达量下降，导致EphA4/A5受体与EphrinA5配体失衡，使突触的形态和功能受损，这可能与BaP引起的小鼠认知功能障碍有关。

综上所述，BaP 致小鼠学习记忆能力下降，大脑皮质突触相关蛋白SYP、PSD95 表达量逐渐下降，EphA4/A5 和EphrinA5 蛋白表达失衡，推测BaP 可能通过影响EphA/EphrinA5 蛋白表达，使突触功能受损，导致小鼠认知功能障碍，具体的调控机制尚需进一步研究。