超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法同时测定血清中12种全氟化合物

王铮，张济明，郭剑秋，张磊，戴一鸣，邬春华，周志俊

复旦大学 a.公共卫生学院 b.教育部公共卫生安全重点实验室，上海 200032

全氟化合物（perfluoroalkyl substances，PFAS）是一类人工合成的有机物，因其碳链上所有氢原子被氟原子取代而得名。PFAS 具有亲水亲脂性、高表面活性、化学稳定性和热稳定性好等特点，被广泛用于制造不粘锅、消防泡沫、食品包装防油涂层和衣物的防水涂层等，也随之进入环境并造成了人群广泛暴露，常见的PFAS 包括全氟羧酸类化合物（如全氟辛酸）及全氟磺酸类化合物（如全氟辛基磺酸）等［1］。研究表明，PFAS 暴露可能与多种不良健康效应如低出生体重、肥胖、甲状腺功能紊乱等有关［2］，因此有必要对人群PFAS 暴露负荷进行监测。然而目前PFAS 的检测方法大多局限于环境样品，有关生物样品中PFAS的检测方法较少，所以建立快速准确的定量检测生物样品中多种PFAS 的方法，对监测人群PFAS 暴露水平，进而评估其暴露风险和可能的健康效应具有重要意义。

目前常见PFAS 的分析方法主要包括色谱法和色谱-质谱联用法等，其中液相色谱串联质谱法无须衍生，结合固相萃取（solid phase extraction，SPE）［3］、加速溶剂萃取［4］等预处理技术，可使得血液中PFAS 的检出限低至ng·L-1水平，是检测生物样本中PFAS 浓度的首选方法。本研究选取文献报道的环境［5］及人体暴露［6］中具有代表性的6 种全氟羧酸类化合物（全氟庚酸、全氟辛酸、全氟壬酸、全氟癸酸、全氟十一烷酸、全氟十二烷酸）、5 种全氟磺酸类化合物（全氟丁基磺酸、全氟己基磺酸、全氟庚基磺酸、全氟辛基磺酸、全氟癸基磺酸）以及1 种全氟磺酰胺类化合物（全氟辛基磺酰胺），通过酶水解、乙腈沉淀蛋白和SPE 等方法对血清样品中的目标物进行提取、净化和富集，应用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（ultra-high performance liquid chromatographyquadrupole/orbitrap high resolution mass spectrometry，UPLC-Q-Orbitrap HRMS）建立快速准确同时检测血清中12 种PFAS 的方法，以实现生物监测中大样本分析的需要，为PFAS 的暴露评估和相关研究的开展提供技术支撑，12种PFAS 的结构如图1。

图1 12种PFAS 的化学结构式Figure 1 Structural formula of 12 PFAS

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Ultimate 3000超高效液相色谱串联Q-Exactive™四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱系统（ThermoFisher，美国）；SpeedVac SPD1030真空浓缩仪（ThermoFisher，美国）；Hypersil GOLD C18 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm，ThermoFisher，美国）；Milli-Q 超纯水系统（Merck，德国）；Oasis HLB SPE柱（30 mg，1 mL，Waters，美国）；Supelclean ENVI-18 SPE柱（100 mg，1 mL，Sigma-Aldrich，美国）；ProElut PLS SPE柱（30 mg，1 mL，Dikma，中国）。

12 种PFAS 标准品：全氟庚酸、全氟辛酸、全氟壬酸、全氟癸酸、全氟十一烷酸、全氟十二烷酸、全氟丁基磺酸、全氟辛基磺酸（纯度分别为99%、分析纯、分析纯、98%、96%、分析纯、97%、96.4%，Sigma-Aldrich，美国），全氟己基磺酸（分析纯，Apollo Scientific，英国），全氟庚基磺酸、全氟辛基磺酰胺（纯度分别为95.3%和96.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH，德国），全氟癸基磺酸（分析纯，Chiron AS，挪威）；2 种PFAS 同位素内标：13C8-全氟辛酸和13C8-全氟辛基磺酸（纯度均为99%，Cambridge Isotope Laboratories，美国）；β-葡萄糖醛酸酶（Sigma-Aldrich，美国）；乙酸-乙酸铵缓冲液（pH=5，厦门海标科技有限公司，中国）；胎牛血清（Sigma-Aldrich，美国）；甲醇、乙腈、异丙醇、乙酸及乙酸铵（色谱级，Sigma-Aldrich，美国）。

12种目标物的定量离子和质荷比如表1所示。

表1 12种目标物的定量离子和质荷比Table 1 Quantitative ions and mass-to-charge ratios of 12 analytes

1.2 标准溶液、校准曲线及质控样品的配制

将12种标准品和2种同位素内标用甲醇配制成质量浓度（后简称，浓度）为10 mg·L-1的单标储备液，置于-20℃冰箱保存。标准储备液用甲醇稀释成2 mg·L-1的工作液。分别取一定量各标准工作液和内标工作液，用甲醇稀释成0.1 mg·L-1的混标溶液和0.1 mg·L-1的内标混合液，置于4℃冰箱保存。

用50%（体积分数）甲醇溶液稀释混标溶液，配制含10 个浓度水平（0、0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μg·L-1）的标准曲线（其中全氟庚酸和全氟辛基磺酸实际纳入标准曲线计算的为8 个浓度水平，不含0.01 μg·L-1和0.05 μg·L-1；全氟癸基磺酸和全氟辛基磺酰胺实际纳入标准曲线计算的为9 个浓度水平，不含0.01 μg·L-1）。在胎牛血清中加入混标溶液，配制与标准曲线相同浓度水平的工作曲线及低、中、高3 个浓度（0.20、1.00、5.00 μg·L-1）的质控样品，置于4℃冰箱保存。

1.3 样品预处理

将源自某出生队列研究对象的脐带血清样品［项目获得复旦大学公共卫生学院伦理委员会批准（批准号：IRB#2016-12-0607），取样时均征得孕妇及家属知情同意］从-80℃冰箱中取出，室温解冻。震荡混匀后取200 μL 样品置于1.5 mL 尖底离心管，随后依次加入0.1 mg·L-1同位素内标10 μL，pH=5.0 的乙酸-乙酸铵缓冲溶液100 μL，β-葡萄糖醛酸酶15 μL，漩涡混匀后于37℃水浴6 h。冷却至室温后加入200 μL 乙腈漩涡混匀，在4℃下以21 380×g离心10 min。取上清液上样于经1 mL 甲醇和1 mL 超纯水活化后的SPE 柱，再用1 mL超纯水和1 mL 淋洗液淋洗，最后用2 mL 洗脱液洗脱。分别比较应用3种SPE 柱（ProElut PLS 柱、Oasis HLB 柱和Supelclean ENVI-18 柱）、4 种不同比例甲醇淋洗液（体积分数分别为10%、30%、50%和70%）和3 种洗脱液（甲醇、乙腈和异丙醇）对SPE 回收率的影响，优化SPE 条件。收集洗脱液置于真空浓缩仪，浓缩2 h 至近干。加入200 μL 甲醇-水溶液（1 ∶1，体积比）复溶，漩涡混匀后移至进样小瓶，待测。

1.4 仪器条件

色谱分析条件如下。色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱温：40℃；流速：0.4 mL·min-1；进样量10 μL；流动相：分别考察3 种流动相体系，水溶液（A）-甲醇溶液（B）、含1 mmol·L-1乙酸铵的水溶液（A）-含1 mmol·L-1乙酸铵的甲醇溶液（B）和含5 mmol·L-1乙酸铵的水溶液（A）-含5 mmol·L-1乙酸铵的甲醇溶液（B）。在混合器和进样环之间增加1 根色谱柱（Thermo Hypersil GOLD C18柱，100 mm×2.1 mm，1.9 μm）。流动相梯度洗脱程序为0～1 min，5% B；1～2 min，5%～30% B；2～6 min，30%～90% B；6～7 min，90%～100% B；7～8 min，100%～5% B；8～10 min，5% B。

质谱分析条件如下。加热电喷雾离子源：负离子模式监测；离子传输管温度：320℃；喷雾电压：-3.0 kV；鞘气流速：40 arb（Thermo 质谱任意单位，仅适用于Thermo 质谱，后同）；辅助气流速：15 arb；辅助气温度：300℃；扫描方式：全扫描；扫描范围（质荷比）：150～1 000；分辨率：70 000（半峰宽）；C-trap容量（AGC target）：3×106；C-trap 注入时间：200 ms。

2 结果

2.1 SPE条件的确定

如表2所示，本研究以空白加标样品和标准品响应的比值计算绝对回收率。比较了10 μg·L-1空白加标样品经Supelclean ENVI-18 SPE柱、ProElut PLS SPE柱和Oasis HLB SPE柱预处理后的回收率，发现Oasis HLB SPE柱对长链和中长链PFAS都具有较好的保留，除全氟庚酸外绝对回收率均超过50%，因此实验最终选用Oasis HLB SPE柱。本研究还考察了四种不同比例的甲醇淋洗液对Oasis HLB SPE柱回收率的影响，用10%和30%（体积分数）的甲醇淋洗后用异丙醇洗脱回收率为39%～103%，用50%（体积分数）甲醇淋洗时短链PFAS 如全氟庚酸和全氟丁基磺酸基本无回收，而用70%（体积分数）甲醇淋洗时除全氟癸基磺酸和全氟辛基磺酰胺外的目标物都几乎不回收，因此本研究最终选用30%（体积分数）甲醇作为淋洗液。实验还发现以30%（体积分数）的甲醇淋洗Oasis HLB SPE 柱后应用乙腈、甲醇和异丙醇三种不同极性的洗脱液均有较好的绝对回收率，因此选择了急性毒性较小的异丙醇作为洗脱液。

表2 不同SPE条件对绝对回收率的影响Table 2 Absolute recovery rates under various SPE conditions单位（Unit）：%

2.2 色谱条件的确定

本实验选用Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱进行目标物的分离，考察3种不同的流动相体系（水-甲醇、含1 mmol·L-1乙酸铵的水-甲醇以及含5 mmol·L-1乙酸铵的水-甲醇），实验表明应用含5 mmol·L-1乙酸铵的水-甲醇体系做流动相时，目标物在色谱柱上分离较好，峰形对称，如图2所示。

图2 质控样品12种PFAS 及2 种同位素内标的提取离子流图Figure 2 Extracted ion chromatogram of 12 PFAS and 2 isotopeinternal standards in quality control samples

2.3 背景值的消除

应用预分离色谱柱分离背景干扰与样品中的目标物。以全氟庚酸为例，在进样全氟庚酸标准溶液后，样品中全氟庚酸峰与仪器析出的全氟庚酸峰完全分离，如图3所示。

2.4 校准曲线和定量限

以13C8-全氟辛酸作为全氟羧酸类化合物的内标，13C8-全氟辛基磺酸作为全氟磺酸类及全氟磺酰胺类化合物的内标，以目标化合物浓度为横坐标，目标化合物峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标绘制标准曲线，各目标物标准曲线线性良好。以同样方法绘制工作曲线，全氟庚酸和全氟辛基磺酸的线性范围为0.10～10.00 μg·L-1，全氟癸基磺酸和全氟辛基磺酰胺的线性范围为0.05～10.00 μg·L-1，其余8 种待测目标物的工作曲线线性范围均为0.01～10.00 μg·L-1，相关系数r均大于0.996。以10 倍信噪比浓度定义方法定量限（limit of quantitation，LOQ），12 种PFAS 的工作曲线及LOQ 如表3所示。

图3 改进前（A）、后（B）0.5 μg·L-1样品中全氟庚酸的提取离子流图Figure 3 Extracted ion chromatograms of perfluoroheptanoic acid before (A) and after (B) modification in 0.5 μg·L-1 standard sample

表3 血清中12 种PFAS的工作曲线、相关系数和定量限Table 3 Working curve,correlation coefficient,and limit of quantification of 12 PFAS in serum

2.5 精密度和准确度

以空白样品加标回收率表示方法的准确度，以相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）表示方法的精密度。对低、中、高三个浓度（0.2、1.0、5.0 μg·L-1）的质控样品进行预处理和分析，每一个浓度水平进行5 次平行测定，计算各目标物的加标回收率和日内精密度。连续3 d 重复上述操作，计算各目标物的日间精密度。目标化合物平均回收率在81.0%～123.7%之间，日内RSD 在1.2%～14.8%之间，日间RSD 在0.4%～16.1%之间。12 种PFAS 的平均回收率及日内和日间RSD 见表4。结果显示本方法回收率高，精密度良好，可以用于血清中12种PFAS的准确定量。

表4 3 种质量浓度质控样品检测方法的准确度和精密度（n=5）Table 4 Accuracy and precision of established method in quality control samples at different concentrations (n=5)单位（Unit）：%

2.6 实际样品分析

应用本方法，检测了20份新生儿脐带血清中12种PFAS浓度，结果如表5所示，低于定量限的值以根号二分之定量限计算。PFAS在所有样品中均有检出，浓度变异较大，不同PFAS的检出率不同，除全氟癸基磺酸和全氟辛基磺酰胺的检出率低于20%外，其他10种PFAS的检出率≥90%。全氟辛酸和全氟辛基磺酸是检出浓度最高的两种PFAS，中位数分别为3.53 μg·L-1和2.03 μg·L-1。

表5 20 份脐带血样品中12种PFAS 检出率及质量浓度分布Table 5 Distribution of 12 PFAS positive rates and concentrations in 20 cord blood serum samples

3 讨论

本研究通过对血清样品预处理和仪器分析条件的优化，同时通过增加预分离色谱柱消除仪器背景干扰，建立了基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS 技术的快速、准确、同时测定血清中12 种PFAS 浓度的方法，方法定量限为0.01～0.10 μg·L-1，12 种目标物平均回收率在81.0%～123.7%之间，日内和日间RSD 分别为1.2%～14.8%和0.4%～16.1%。将方法应用于新生儿脐带血清样本的检测，PFAS 在所有样品中均有检出，此方法可以满足日常检测的需要。

由于血清样品基质复杂，PFAS 含量低微，对目标物提取和富集是样品预处理的重要环节。PFAS 易与血清中的白蛋白结合而在血液中蓄积［7］，因此实验采用β-葡萄糖醛酸酶水解结合态PFAS，加入乙腈振荡离心以沉淀蛋白后再经SPE 柱提取净化。SPE 技术具有溶剂用量少、分离效果好、操作简便重现性好等优点，然而不同SPE 柱的品牌及填料类型、淋洗溶剂及洗脱溶剂等条件对SPE 的回收率有较大影响。相较于C18柱（Supelclean ENVI-18 SPE 柱），亲水亲脂柱（ProElut PLS SPE柱和Oasis HLB SPE柱）对PFAS的保留能力更好。随着淋洗液中甲醇比例的增加，淋洗液的洗脱能力增强，50%和70%（体积分数）甲醇淋洗液的洗脱能力过强，会将PFAS从SPE柱上洗脱，造成较低的绝对回收率。

色谱柱和流动相的选择是分离复杂基质中多种目标物的关键。PFAS 作为一类极性物质，本研究根据文献报道选择了最常用的C18反相色谱柱，以水-甲醇流动相体系进行分离。考虑到本研究主要检测的目标物为羧酸及磺酸类物质，添加缓冲盐可以有效地调节流动相pH，抑制目标物解离，改善峰形，因此在流动相体系中加入一定量的乙酸铵调节流动相pH 和离子浓度。

低背景值是获得准确定量的前提条件，由于PFAS具有亲水亲脂性和高表面活性，其多聚物如聚四氟乙烯常被用于液相色谱管路的制作，既有研究表明PFAS在仪器空白中有较高检出［8］。与孙瑞［9］的报道相似，本研究仪器的背景值主要为泵前聚四氟乙烯管路中析出的全氟辛酸和全氟庚酸。为解决这一问题，参照现有研究［10］在混合器和进样环之间增加一根色谱柱，使得泵前析出的PFAS在前端色谱柱上先进行分离，使仪器析出的PFAS 的出峰时间相比实际样品中PFAS 出峰时间延长，成功实现对目标物的分离并准确定量。

UPLC-Q-Orbitrap HRMS 作为近年来新研发的高分辨率质谱，以其优越的性能被广泛用于定性检测，同时其在定量分析上也有较好的表现［11］。研究显示在定量检测如PFAS 等痕量化学物质时，Orbitrap 高分辨率质谱与三重四极杆质谱相比，检出限、精密度和准确度相近［12］。本方法与现有方法［13-15］相比，具有定量限低、样品用量少、分析时间短等优点，应用本方法在20 份脐带血样本中均检出了PFAS，大部分目标物的检出率为100%，可满足大样本生物监测中快速、准确、同时测定血清中多种PFAS 的实际需求。