lncRNA MRAK050699对二氧化硅粉尘诱导大鼠肺泡II型上皮细胞上皮-间质转换的影响

宁夏医科大学公共卫生与管理学院，宁夏 银川 750004

矽肺是最严重的职业病之一，其发病机制尚未明确［1］。它是由于肺部遭受长期刺激导致肺间质炎症、成纤维细胞和肌成纤维细胞增生，进而产生纤维化所致［2］。越来越多的证据表明，有多种因素参与致纤维化的病理过程。非编码RNA 表达异常与多种纤维化疾病有关，在肺纤维化中也已证实，这为探索新的矽肺治疗靶点提供了思路［3-4］。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是指长度超过200 个核苷酸的一种RNA 转录本，缺乏开放的阅读框架，曾经被认为是无意义的“转录噪音”。近年来的研究发现它们可能广泛参与各种细胞过程的调控，包括肺组织的纤维化［5-6］。有研究表明，游离的二氧化硅（silicon dioxide，SiO2）可激活肺泡巨噬细胞，使其分泌出促纤维化的细胞因子，如转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）［7］。TGF-β 可诱导上皮-间质转换（epithelial-mesenchymal transition，EMT），使肺泡II 型上皮细胞发生表型改变，肌成纤维细胞增多，细胞外基质（extracellular matrix，ECM）大量沉积［8-10］。在EMT 过程中，多种相关因子会发生变化，如上皮标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）转换为间充质标志物N-钙黏蛋白（N-cadherin）［11］，增多的肌成纤维细胞大量表达α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）［12-13］。lncRNA MRAK050699 是本课题组利用非暴露气管注入的方式建立矽肺大鼠模型后，使用lncRNA 芯片筛选技术筛选出的lncRNA。我们发现在其lncRNA 表达谱中，矽肺模型组大鼠相较正常组MRAK050699 的表达上调，说明MRAK050699 可能参与了矽肺纤维化的过程。本次实验通过建立大鼠肺泡II 型上皮细胞（RLE-6TN 细胞）与大鼠肺泡巨噬细胞（NR8383 细胞）共培养体系，模拟矽肺大鼠体外模型，并转染敲减MRAK050699 的慢病毒，检测相关因子的表达，探讨MRAK050699 在矽肺体外模型中对大鼠肺泡II型上皮细胞EMT 的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

NR8383 细胞、RLE-6TN 细胞均购于上海名劲生物科技有限公司；游离SiO2粉尘（美国Sigma 公司），CCK-8 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（上海贝博公司），TGF-β 细胞因子酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒（上海酶联生物公司），RPMI1640 培养基（美国Gibco 公司），Ham’s F-12K 营养培养基（上海源培生物公司），Transwell 共培养小室（美国Corning 公司），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（美国BI 公司），青链霉素混合液（双抗）、胰酶（北京索莱宝科技有限公司），二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）（美国MP 公司），磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）（美国Hyclone 公司），兔抗鼠E-cadherin、α-SMA抗体（美国Abcom 公司），兔抗鼠N-cadherin 抗体（美国Proteintech 公司）、小鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）单抗（北京中杉金桥公司）、MRAK050699 敲减病毒以及阴性对照病毒、转染增强液HiTransG A、嘌呤霉素（上海吉凯公司），Trizol、聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（美国Invitrogen 公司），TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（北京全式金公司），MRAK050699、E-cadherin、N-cadherin、α-SMA及GAPDH引物（上海生工生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养RLE-6TN 细胞传代培养，培养条件为含有青霉素（100 U·mL-1）、链霉素（100 μg·mL-1）以及10% FBS的Ham’s F-12K营养培养基，当细胞融合至90%时，弃去旧培养基，消化并离心收集细胞。用完全培养基重悬细胞，分瓶培养，2 d 换液一次。取3～8 代细胞备用。

NR8383 细胞传代培养，培养条件为含有青霉素（100 U·mL-1）、链霉素（100 μg·mL-1）以及15% FBS 的Ham’s F-12K 营养培养基，当细胞增殖至90%时，分瓶培养。取3～8代细胞备用。

1.2.2 RLE-6TN 细胞转染敲减病毒转染前24 h，向6 孔板中每孔接种 5×104个RLE-6TN 细胞，于37℃、5% CO2培养箱中培养过夜，将培养基替换为加入转染增强液HiTransG A 及病毒（阴性对照慢病毒或敲减病毒）（感染复数=25）的培养基，孵育过夜后移除培养基并更替为完全培养基继续培养，感染约72 h 时，替换培养基，加入浓度为2 μg·mL-1的嘌呤霉素筛选单克隆细胞簇。将单克隆细胞簇扩大培养，冻存备用。将转染后的RLE-6TN细胞与NR8383细胞共培养。转染了阴性对照慢病毒的细胞系命名为敲减对照组，转染了敲减病毒的细胞系命名为敲减组。

1.2.3 实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，RT-qPCR）法检测lncRNA MRAK050699表达水平为验证lncRNA MRAK050699 是否敲减成功，将细胞分为三组：正常组、敲减对照组和敲减组，将三组细胞接种于6孔板中（接种密度为5×105），以第2天长满为最佳。次日弃去6孔板中的培养液，加入1 mL预冷的PBS清洗细胞，收集至 1.5 mL离心管中，12 000×g，5 min进行离心，弃上清。每管加1 mL Trizol，震荡充分裂解细胞，静置5 min；参照反转录试剂盒说明书合成cDNA，并进行PCR扩增，引物序列见表1。反应条件为95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火并延伸30 s，40个循环。以GAPDH为内参，计算基因相对表达。

1.2.4 共培养体系建立实验分为四组培养体系，分别为正常组、模型组、敲减对照组以及敲减组。取四个6 孔板，在前两个6 孔板中正常培养RLE-6TN 细胞24 h（接种密度为5×105），后两个6 孔板分别培养转染阴性对照病毒的RLE-6TN 细胞24 h，和转染敲减病毒的RLE-6TN 细胞24 h，至细胞60%～70%融合；同时在另四个6 孔板中，插入Transwell 共培养小室，正常培 养NR8383 细 胞24 h。NR8383 细 胞与RLE-6TN 细 胞铺板比例为1∶2，之后将Transwell 共培养小室连同NR8383 细胞一同转入RLE-6TN 细胞的6 孔板中，向后三组共培养体系的Transwell 共培养小室中加入150 μL 40 μg·cm-2SiO2粉尘悬液后，四组同时继续培养24 h。

1.2.5 CCK8 法检测NR8383 在粉尘刺激下的细胞增殖活性用15% FBS 的Ham’s F-12K 营养培养基重悬NR8383，以每孔1.5×104个细胞（每孔100 μL）接种于96孔板，置于5% CO2、37℃培养箱内培养24 h。加入10、20、40、80、160、320 μg·cm-2的SiO2粉尘悬液15 μL，继续培养24 h，加入CCK8 溶液10 μL，37℃孵育4 h 后测定各孔光密度值（D）。按照CCK8试剂盒说明书选取波长为450 nm进行测定，每组设6个复孔，以无细胞、只加培养液的组为空白组，以只加培养液、不加粉尘干预的细胞为对照组，按下列公式计算细胞存活率：细胞存活率=［（D实验组-D空白组）/（D对照组-D空白组）］×100%。

1.2.6 ELISA 法检测经粉尘刺激后NR8383 上清液中TGF-β 含量将经0、20、40、80 μg·cm-2SiO2粉尘处理24 h 后的NR8383 细胞的上清液收集，12 000×g，离心20 min，取上清待测。将试剂盒从冷藏环境中取出放在室温平衡1 h 待用。严格按照试剂盒说明书进行操作。15 min 内用酶标仪在450 nm 处测光密度值（D）。以标准品为横坐标，D值为纵坐标，制作标准曲线。根据样品D值在该曲线图上查出相应样本中待测因子蛋白含量。

1.2.7 共培养后RLE-6TN 的形态学观察按照方法“1.2.4”，进行共培养24 h 后，将Transwell 共培养小室下室置于显微镜下，观察粉尘刺激后各组细胞的形态学变化。

1.2.8 RT-qPCR法检测RLE-6TN中E-cadherin、N-cadherin、α-SMA 相对表达量共培养24 h 后，取下层6 孔板进行 RT-qPCR 检测，方法同“1.2.4”。引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 RT-qPCR primer sequence

1.2.9 蛋白免疫印记（Western blotting）法测定RLE-6TN细胞中各蛋白的相对表达配制不同浓度SDS-PAGE凝胶。加入电泳液后，进行上样。80 V稳压电泳约30 min，待样品进入分离胶后，调整电压为120 V继续电泳。电泳结束后，在300 mA 电流下转膜。使用5%脱脂奶粉封闭液，室温封闭1 h。按照1∶1 000 稀释一抗，涂于PVDF 膜表面，在4℃冰箱过夜。次日用TBST 洗膜3 次，每次10 min。加入1∶2 500 稀释的二抗室温封闭1 h。再次用TBST 洗膜，使用化学发光凝胶成像仪曝光。使用Image J 1.8.0 软件对光密度值进行分析，蛋白相对表达量为目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

1.3 统计学分析

所有数据均以采用SPSS 22.0 进行分析，使用Means±SD表示，组间统计学差异采用one-way ANOVA和LSD 法检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 转染后的RLE-6TN细胞中MRAK050699 的mRNA表达水平

敲减组MRAK050699 的表达水平相比敲减对照组明显下调，转染效率约为50%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与敲减对照组相比，正常组MRAK050699的mRNA表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 SiO2粉尘对NR8383细胞活力的影响

不同剂量SiO2粉尘刺激NR8383 细胞，随着粉尘刺激剂量的增加，细胞的存活率出现不同程度降低，10、20、40、80、160、320 μg·cm-2组细胞存活率分别为（91.2±0.25）%、（76.55±3.46）%、（59.00±1.61）%、（26.46±0.89）%、（24.37±3.20）%、（38.25±1.89）%。SiO2粉尘剂量在40 μg·cm-2时，细胞活力下降较为明显且可保证后续实验的有效进行。其他染尘组与40 μg·cm-2组相比，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 NR8383细胞上清液中TGF-β含量

粉尘剂量在40 μg·cm-2时，NR8383 细胞上清中TGF-β 蛋白的表达水平较高，是对照组0 μg·cm-2的2.94 倍，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.4 SiO2 粉尘刺激共培养体系后引起RLE-6TN 细胞的形态变化

从图1中可以看出正常组的细胞呈现典型的上皮样特征，为多边形、卵圆形且紧密连接。模型组细胞呈现间质样细胞形态，表现为长梭形、纺锤形，并且细胞间隙变宽。敲减对照组与模型组类似，呈现间质细胞形态。而敲减组细胞基本处于紧密连接状态。

2.5 RLE-6TN细胞中E-cadherin、N-cadherin、α-SMA的mRNA表达水平

各组上述基因的表达差异均有统计学意义（F=28.11、35.72、15.26，P＜0.05）。模型组的E-cadherin、N-cadherin、α-SMA的mRNA 表达水平分别是正常组的32%，以及2.28、2.74 倍，差异有统计学意义（P＜0.05）。相较于敲减对照组，敲减组E-cadherinmRNA表达水平上升，而N-cadherin、α-SMA的mRNA 表达水平下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。模型组与敲减对照组的各基因mRNA表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

图1 40 μg·cm-2的SiO2粉尘刺激共培养体系后RLE-6TN细胞形态Figure 1 Morphology of RLE-6TN cells after 40 μg·cm-2 SiO2 dust stimulation

图2 40 μg·cm-2的SiO2粉尘刺激共培养体系后RLE-6TN细胞各组基因相对表达水平Figure 2 Relative expression levels of selected genes in each group of RLE-6TN cells after 40 μg·cm-2 SiO2 dust stimulation

2.6 RLE-6TN细胞中E-cadherin、N-cadherin、α-SMA的蛋白表达水平

各组上述蛋白的表达水平均有统计学意义（F=328.78、51.84、13.39，P＜0.05）。模型组的E-cadherin、N-cadherin、α-SMA 的蛋白表达水平分别是正常组的67%，以及1.64、1.66倍，差异有统计学意义（P＜0.05）。敲减组相较于敲减对照组，E-cadherin 蛋白表达水平上升，而N-cadherin、α-SMA 的蛋白表达水平下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。模型组与敲减对照组的各蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

图3 40 μg·cm-2的SiO2粉尘刺激共培养体系后RLE-6TN细胞各组蛋白相对表达水平Figure 3 Relative expression levels of selected proteins in each group of RLE-6TN cells after 40 μg·cm-2 SiO2 dust stimulation

3 讨论

在矽肺的致病机制中，EMT 过程占据重要地位。EMT 是一种细胞生物学过程，在此过程中细胞失去上皮细胞特性而获得间充质细胞的特征［14］，肺泡II 型上皮细胞是肌成纤维细胞的重要来源［15］。有研究表明，SiO2诱导的矽肺大鼠模型中有682 个lncRNAs 的表达谱发生改变［16］。lncRNA Loc103691771 的异常表达与矽肺的发生发展有关［17］。Qian 等［18］的研究发现lncRNAZEB1 ZEB1-AS1 在大鼠肺纤维化组织和TGF-β1诱导的RLE-6TN 细胞中表达上调。而据本课题组前期研究发现在矽肺模型组大鼠中确实存在大量差异表达的lncRNA，其中MRAK050699 是明显上调的。那么上调的MRAK050699 是否会在TGF-β 诱导EMT 过程中发挥作用？

肺泡巨噬细胞在维持肺内免疫稳态和宿主防御中起主要作用，粉尘进入呼吸道首先与巨噬细胞接触［19］。因此，建立肺泡巨噬细胞与肺泡Ⅱ型上皮细胞共培养体系，可以更好地模拟矽肺体内细胞环境。同时对RLE-6TN 细胞转染敲减的MRAK050699 慢病毒，使MRAK050699 在细胞中的表达降低，以此检测EMT的相关因子，验证MRAK050699 在SiO2粉尘诱导大鼠II 型肺泡上皮细胞发生EMT 过程中是否有影响。

据此次研究结果显示，NR8383 细胞在40 μg·cm-2时活力下降明显；同时TGF-β 表达水平较高。将共培养模型中的RLE-6TN 细胞置于显微镜下观察，结果显示正常组的细胞呈现典型的上皮样特征，模型组细胞与敲减对照组类似，失去了上皮表型获得了间充质细胞的表型特征，而敲减组细胞的间充质细胞表型特征不明显［20］。以上结果提示体外矽肺模型建立成功。与正常组相比，模型组E-cadherin基因及蛋白的表达水平均降低，N-cadherin、α-SMA基因及蛋白的表达水平均升高，提示RLE-6TN 细胞发生了EMT 过程。在转染了敲减MRAK050699 的慢病毒后，相较于敲减对照组，敲减组E-cadherin基因及蛋白的表达水平均升高，N-cadherin、α-SMA基因及蛋白的表达水平均降低，提示低表达的MRAK050699 可减缓TGF-β 诱导RLE-6TN细胞的EMT 过程。与模型组相比，转染了阴性对照病毒的敲减对照组中各因子的mRNA和蛋白表达水平均无差异，证明转染的阴性对照病毒未在RLE-6TN 细胞发生EMT 过程中造成影响。

以上结果显示，在粉尘刺激NR8383 细胞后，NR8383细胞分泌出的致纤维化的因子会导致RLE-6TN细胞发生EMT 过程，抑制E-cadherin，增强N-cadherin的表达，使上皮细胞转化为大量表达α-SMA 阳性的肌成纤维细胞［21］。据前期芯片结果显示差异表达的MRAK050699 是与TGF-β1 型受体相关的lncRNA，前期结果也已验证lncRNA MRAK050699 表达水平上调，介导了TGF-β1 型受体的上调和TGF-β 信号通路的激活。MRAK050699 的敲减使得肺泡上皮细胞中TGF-β1 型受体较敲减对照组减少，TGF-β 作用于RLE-6TN 时，由于受体减少，TGF-β 与受体结合也相应减少，因此一定程度上减弱了TGF-β 诱导EMT 过程。但是矽肺的发病机制十分复杂，lncRNA 在其间的作用网络至今未明确，本研究仅通过体外细胞实验验证了MRAK050699影响了EMT 相关因子的表达。MRAK050699 在矽肺发病机制网络中的具体作用机制还需更深入的研究。