扶阳宣痹汤对大鼠椎间盘退变及基质金属蛋白酶表达的影响

杨光露 郭杨△ 马勇 涂鹏程 孙杰 许炜民 吴承杰

椎间盘退行性病变(Intervertebral Disc Degeneration，IDD)是腰椎间盘突出症、盘源性腰痛等骨科常见疾病发生发展的重要病理过程[1-2]，一般多发于中老年人[3]，但随着互联网应用的普及和生活节奏的加快，IDD越来越多在中青年人群中发现，加重了社会经济负担[4]。研究表明IDD的进展受到多种因素如椎体力学失衡、炎症、代谢疾病等的影响[5-8]。退变椎间盘在炎性因子及降解酶(如白细胞介素1(Interleukin-1，IL-1)、基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMP)等)的浸润下，使二型胶原(Collagen Ⅱ，COL2A1)、蛋白多糖(Aggrecan)等髓核基质大分子分解增加，最终造成椎间盘基质的生物力学特性不断丧失[9-12]。因此抑制炎性因子及降解酶的生成，促进基质合成对改善IDD尤为重要。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年健康SPF(无特定病原体)级SD大鼠60只，雌雄各半，体质量180～220 g，由南京青龙山动物中心提供，动物许可证号SCXK(浙)2019-0002。

1.2 实验药物及试剂

扶阳宣痹汤，国家发明专利ZL201711188654.1。组合：黄芪30 g，桂枝30 g，白芍30 g，附子12 g，薏苡仁12 g，甘草10 g，干姜6 g等。饮片购自南京中医药大学附属医院药剂科。腰痹通胶囊(中国康缘公司，401206)；苏木精-伊红(HE)染色液(中国雷根公司，DH0006)；MMP9、MMP13、GAPDH抗体(美国Proteintech公司，10375-2-AP，18165-1-AP，10494-1-AP)；Aggrecan及COL2A1抗体、羊抗兔二抗(美国Abcam公司，ab36861，ab188570，ab205718)；ReverTraAce qPCR反转录试剂盒、SYBR Green Realtime PCR Master Mix定量试剂盒(日本TaKaRa公司，批号RR036A及RR820A)。

1.3 实验仪器

PharmaScan 7.0T小动物磁共振成像系统(德国Bruker公司)；PerkinElmer酶标仪(美国Bio-Tek公司)，聚合酶链式反应(PCR)自动系列化分析仪(美国ABI公司)，化学发光成像仪(美国GE Healthcare公司)，蛋白半干转印仪及电泳仪(美国Bio-Bad公司)，微孔板离心机及各量程移液器(德国Eppendorf公司)，生物显微镜-图像分析系统(德国Leica公司)，全自动硬组织切片机(德国Leica公司)。

1.4 方法

1.4.1造模方法 除空白组外均需要采用尾椎纤维环穿刺法制备椎间盘退变模型。模型制备：按Bian[13]的方法，大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后，消毒大鼠尾部，29G针头行尾椎穿刺，穿刺节段为Co5/6/7，避开大鼠尾动静脉，向椎间盘中心，穿刺深度为5 mm，刺入椎间隙后针头旋转360°留置10 s，碘伏消毒并标记位置后给予创可贴保护。

1.4.2分组方法 将大鼠随机分为空白组，模型组，腰痹通组，扶阳宣痹汤低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组10只。

1.4.3干预方法 造模成功后，根据不同动物等效剂量的折算系数表[14]，空白组、模型组均给予生理盐水(10 mL/(kg·d))；腰痹通组给予腰痹通溶液(0.34 g/(kg·d))，扶阳宣痹汤低、中、高剂量组分别给予扶阳宣痹汤低剂量(8.19 g/(kg·d))、中剂量(16.38 g/(kg·d))、高剂量(32.76 g/(kg·d))，连续给药4周。

1.4.4标本制作方法 大鼠给药治疗4周后，腹腔注射3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉，脱颈处死，取整条尾椎于冰上，分离Co5/6/7椎间盘组织，预冷生理盐水冲洗后，Co5置于4%多聚甲醛中固定，用于HE染色和免疫组化观察椎间盘退变；Co6及Co7置于-80 ℃保存，用于蛋白免疫印迹法(Western Blot)及PCR检测。

1.5 实验指标测定

磁共振成像(MRI)检测椎间盘退变：给药4周后，每组大鼠随机抽取3只，利用小动物磁共振成像系统(7.0T)扫描大鼠脊柱尾椎椎间盘组织形态，获取尾椎间盘及髓核信号变化并采用Piffimann椎间盘评分系统进行评估，计算椎间盘的退变率[15]。

HE染色检测椎间盘病理变化：每组大鼠随机抽取3只，大鼠处死后取标记位置的Co5椎间盘组织，经4%多聚甲醛中固定24 h，甲酸脱钙液脱钙72 h，再经梯度乙醇脱水，二甲苯透明处理，浸蜡，常规包埋，石蜡切片，厚度约6 μm；依次烤片过夜，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，苏木素染色，盐酸乙醇分化，再经伊红染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，最后显微镜下观察，各组椎间盘组织进行病理学Masuda 评分[16]。

免疫组化检测COL2A1及Aggrecan表达：取各组3只大鼠进行椎间盘石蜡切片，二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化同HE染色，化后切片浸于柠檬酸缓冲液中沸水浴25 min进行抗原修复，滴加2%过氧化氢溶液灭活内源性过氧化物酶，再向切片滴加10%山羊血清，室温封闭1 h，漂洗后滴加一抗(1∶200)，4 ℃孵育过夜，漂洗后滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶1 000)，室温孵育2 h，再经二氨基联苯胺(DAB)染色液染色10 min，苏木素浸染1 min，流水冲洗5 min后依次脱水、透明、封片，显微镜观察每组取3张切片，每张切片随机选取3个不重叠的高倍视野并利用Image-Pro Plus 5.0软件对图像进行分析。

实时聚合酶链式反应(RT-PCR)检测COL2A1、Aggrecan、MMP9及MMP13的mRNA表达：各组大鼠随机抽取3只，从Co6/7椎间盘中提取髓核组织，柱提法提取总RNA，使用ReverTraAce qPCR逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，反应条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，利用SYBR Green Realtime PCR Master Mix定量试剂盒配制20 μL体系进样，反应条件为95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。以GAPDH作为内参进行分析，根据公式2-△△Ct进行半定量计算分析，检测目标分子引物序列(见表1)。

Western Blot检测MMP9及MMP13蛋白的表达：随机抽取3只大鼠，将取出的Co6/7椎间盘加入RIPA裂解液充分研磨后冰上裂解，离心收集总蛋白，经二辛可宁酸(BCA)法定量后，取等量蛋白样品加入等体积缓冲液，煮沸10 min后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶电泳(90 min)，转膜(60 min)，5%奶粉室温封闭(2 h)，一抗(1∶1 000) 4 ℃过夜孵育，二抗(1∶10 000)室温孵育(2 h)，滴加电化学发光(ECL)液显色，凝胶成像系统成像检测MMP9及MMP13蛋白的表达，用Image J图像分析系统进行蛋白条带灰度分析。

表1 目标分子引物序列

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 椎间盘退变的MRI检查及Piffimann椎间盘评分

模型制备4周后行MRI影像学检查，空白组的尾椎间盘T2加权像下呈明显的高信号，而模型组的尾椎间盘信号强度降低，其Piffimann椎间盘评分(7.333±1.211)与空白组(4.667±1.366)相比明显升高(P=0.018)，表示尾椎间盘退变模型制备成功。给药4周后，MRI结果显示：与模型组(10.000±1.789)相比，扶阳宣痹汤低剂量组(8.667±3.141)、中剂量组(7.667±1.367)、高剂量组(5.333±0.516)大鼠椎间盘信号强度均有不同程度地增强，其中扶阳宣痹汤高剂量组的Piffimann椎间盘评分明显下降(P=0.006)，高剂量组与腰痹通组(5.667±1.033)之间差异无统计学意义，见图1。

2.2 椎间盘组织病理学变化及Masuda评分

HE染色结果显示：与空白组比较，模型组椎间盘纤维环排列紊乱，与NP界限模糊，髓核基质凝结、NP细胞减少，其Masuda评分(9.800±0.837)较空白组(5.600±1.140)明显增高(P<0.001)；与模型组比较，扶阳宣痹汤低、中、高剂量组及腰痹通组椎间盘组织病理状态均有改善，其中高剂量组与腰痹通组髓核基质轻微凝结、与纤维环界限清晰、纤维环纹理较正常，中剂量组(7.200±1.483)、高剂量组(5.800±0.837)与腰痹通组(6.000±1.581)的Masuda评分均明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见图2。

图1 大鼠尾椎间盘的核磁共振检查

图2 各组大鼠尾椎间盘的组织病理学表现(HE，×100)

2.3 椎间盘COL2A1及Aggrecan的免疫组化染色

应用Image J分析各组COL2A1及Aggrecan平均灰度值，结果显示：与空白组相比，模型组大鼠椎间盘COL2A1及Aggrecan表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，扶阳宣痹汤高剂量组及腰痹通组椎间盘COL2A1和Aggrecan表达上调，差异有统计学意义(P<0.01)，高剂量组与腰痹通组差异无统计学意义，见图3-图4。

图3 椎间盘二型胶原的免疫组化染色(×400)

图4 椎间盘蛋白多糖的免疫组化染色(×400)

2.4 椎间盘髓核COL2A1、Aggrecan、MMP9及MMP13的mRNA表达

与空白组相比，模型组髓核基质COL2A1及Aggrecan mRNA表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，MMP9及MMP13 mRNA表达明显上调，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，扶阳宣痹汤高剂量组与腰痹通组的髓核基质COL2A1及Aggrecan mRNA表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.01，P<0.01)，中、高剂量组和腰痹通组的MMP9及MMP13 mRNA表达明显下调，差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)，其中高剂量组与腰痹通组之间差异无统计学意义，见表2。

表2 COL2A1、Aggrecan、MMP9及MMP13的mRNA表达

2.5 椎间盘髓核组织MMP9及MMP13的蛋白表达

Western Blot结果显示：与空白组相比，模型组髓核组织MMP9及MMP13蛋白表达显著上调(P<0.01)；与模型组相比，扶阳宣痹汤中、高剂量组及腰痹通组MMP9和MMP13表达显著降低(P<0.05，P<0.01)，扶阳宣痹汤中、高剂量组与腰痹通组之间无统计学差异，见图5。

图5 椎间盘髓核基质金属蛋白酶9、13的蛋白表达

3 讨论

椎间盘是由髓核(Nucleus Pulposus，NP)、纤维环(Annulus Fibrosus，AF)和软骨终板组成。髓核组织是一种高水分凝胶状组织，除NP细胞外，还有富含COL2A1和Aggrecan的细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)。研究表明随着退行性变的增加，促炎因子大量产生，髓核组织水合作用降低，NP细胞由于营养不足开始衰老凋亡或表型改变[17]，细胞凋亡会减少ECM产生，而促炎因子和MMPs又会进一步降解现有的ECM，特别是COL2A1和Aggrecan[18]，基质成分的改变又使椎间盘的力学特性不断丧失，最终形成IDD环[19]。尽管确切的退变机制尚存争议，但COL2A1和Aggrecan等髓核基质大分子在维持椎间盘结构与功能完整性方面发挥着核心作用[20]。笔者已知MMPs能降解ECM中的各种蛋白成分，是组织重塑和胶原降解的主要成分[21]。研究表明暴露于NP细胞的ECM蛋白水解片段可以导致MMP9、MMP13和Fas基因上调，COL2A1和Aggrecan基因下调，进而加重IDD[22-23]。另一项研究也发现IL-1β诱导的IDD在低氧条件下可以通过上调MMP9、MMP13、ADAMTS4及ADAMTS5的表达，下调COL2A1及Aggrecan的表达来协同促进NP细胞的分解代谢[24]，这说明MMP9和MMP13与髓核基质中的COL2A1及Aggrecan在IDD的退变过程中可能存在密切联系。

本实验通过MRI观察椎间盘髓核组织及信号变化，发现模型组信号强度明显降低，扶阳宣痹汤低、中、高剂量组与模型组相比，信号强度及改良Piffimann椎间盘评分均有改善，其中高剂量组改善明显。通过HE染色观察髓核组织，结果显示模型组椎间盘纤维环排列紊乱，与NP界限模糊，NP细胞减少，而扶阳宣痹汤低、中、高剂量组的椎间盘组织病理学变化及Masuda评分均有改善，其中、高剂量组改善明显。以上结果说明NP细胞的凋亡可能是加速IDD的重要环节，而扶阳宣痹汤在椎间盘退变过程中具有一定的改善作用，并且存在剂量依赖性。另外，与空白组相比，模型组髓核基质COL2A1及Aggrecan的mRNA表达明显降低，MMP9及MMP13的mRNA及蛋白表达均明显上调；与模型组相比，扶阳宣痹汤高剂量组及腰痹通组髓核基质COL2A1及Aggrecan 的mRNA表达明显升高，MMP9及MMP13的mRNA表达及蛋白表达均明显下调。以上结果表明扶阳宣痹汤可能通过抑制MMP9和MMP13表达，上调COL2A1及Aggrecan表达来稳定基质合成代谢和分解代谢的平衡，从而缓解或改善退变的椎间盘组织。

中医并无“椎间盘退变”这一病名，它所导致的腰椎间盘突出、盘源性腰痛常被归为“痹症”“腰痛”等疾病。马勇教授认为“阳气者，抗力之枢也”，阳气不足而寒从中生，风寒湿邪留滞而气血凝滞，久而成痹，故临床常以温肾阳、除痹痛为治疗原则治疗此类疾病，并在长期的临床实践中形成了扶阳宣痹汤[25]，临床疗效显著[26-27]。方中附子、桂枝、干姜温扶一身之阳气，黄芪补气实表以行精血津液，鸡血藤活血舒筋除痹，川芎、桃仁、当归以行血分，再添之茯苓、生薏苡仁、木香顾护胃气，以后天滋先天，共奏扶阳散寒、温经通络、通痹止痛之功。现代药理学研究表明附子、黄芪、川芎等具有改善炎性微环境、改善微循环、镇痛、免疫调节等作用[28-30]。

综上所述，本实验研究初步发现扶阳宣痹汤可能通过抑制MMP9及MMP13的生成，上调COL2A1和Aggrecan的表达，从而维持椎间盘基质合成分解代谢平衡，改善大鼠尾椎间盘退行性病变。但是本实验中动物模型制备不够精准，药物化合物成分复杂，且仅从IDD角度探讨扶阳宣痹汤的治疗作用尚有不足，还有待进一步深入研究。