局部微电流刺激对兔胫骨骨缺损部位降钙素基因相关肽表达的影响

姚玉英 张宏 范雅丽 杨东浩 金玉祥 贾丽丽 郭志利△

胫骨骨折是临床常见的膝关节创伤之一，可包括胫骨平台和干骨骨折，多因摔伤、重物打击及车祸伤形成，尤其随着我国交通事业的快速发展，其发生率呈逐年增加趋势[1-2]。因胫骨特殊的解剖结构，其周围皮下组织及外周肌肉较少，一旦受损，易导致局部滋养血管及组织损伤，给临床治疗带来较大的难度，且胫骨骨折后感染引起的骨缺损等并发症，会导致极高的伤残率，给患者生活质量带来严重影响，一直是骨科研究的热点和难点[3-4]。电刺激治疗对胫骨骨缺损修复有着明显的疗效，近些年在临床上得到越来越多的应用[5]。本研究通过对兔胫骨骨缺损部位进行局部微电流刺激，分析其对降钙素基因相关肽表达的影响，阐明其对骨缺损愈合机制，以期为胫骨骨缺损的愈合提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 实验动物

选用新西兰家兔(动物批准号为SCXK(冀)2018-0013)40只，雌雄各半，3个月月龄，体质量2.0～3.0 kg，由河北医科大学动物实验中心提供，饲养于清洁级实验室中(室温22～25 ℃，湿度50%～65%)，给予普通饲料喂养。

1.2 实验药物与试剂

兔多隆抗体CGRP和兔多隆抗体CGRPR-1(武汉博士德公司)、 射用异戊巴比妥钠(广东新亚药业)。

1.3 实验仪器

电子天平(型号为AEL-40SM，日本岛津)、骨密度仪(型号为XR-46，美国 NORLAND公司)、显微镜(型号为Olympus IX71，日本OLYMPUS)、神经刺激仪(型号为LH202H，北京华卫产业开发公司)。

1.4 方法

1.4.1分组、模型制备及干预 将40只新西兰家兔随机分模型组和治疗组(各20只)，适应性饲养1周后，给予2%戊巴比妥钠溶液麻醉，无菌条件下对右膝关节下胫骨上端1/3处进行纵行切口(切口约3 cm)，分离黏膜、筋膜、肌肉至骨膜，采用动力钻形成10 mm×3 mm胫骨近端骨缺损(10 mm×3 mm)，术后清理创口碎骨组织并止血，无菌缝合后包扎，构建胫骨骨缺损模型。两组家兔术后均常规饲养，自由活动，治疗组术后第1天，将电刺激仪正负置于骨缺损所在胫骨近端，负极置于远端神经处，对周围神经点进行刺激，脉冲时间0.6～1.0 ms，脉冲频率2～20 Hz，刺激电流50 mA，1次/d，每次30 min。

1.4.2骨密度(BMD)及骨矿物含量(BMC)检测 造模后1、2、3和4周，各组取5只兔处死后，取右胫骨，并剔除周围附着的肌肉及筋膜。对骨痂BMD和BMC进行检测。

1.4.3三点弯曲力学实验 造模后4周，取各组家兔右胫骨样本，置于MTS试验机上采用三点弯曲法进行生物力学检测，通过仪器记录弹性载荷、弯曲能量、断裂载荷，并计算出刚性系数。

1.4.4免疫组织化检测 造模后1、2、3和4周，各组取5只兔处死后，取右胫骨，切取包含骨缺损在内长度为1 cm的骨组织作为标本，置入10%中性福尔马林溶液固定，15%EDTA溶液中脱钙，脱水，透明，石蜡包埋后连续切片，按照SABC试剂盒剂盒说明书行免疫组织化学染色检测CGRP及受体(CGRPR-1)表达情况，用已知CGRP及CGRPR-1阳性表达的切片作为阳性对照，PBS液代替一抗液作为阴性对照，光镜下观察CGRP及CGRPR-1阳性表达部位与表达强弱并拍照。采用HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统对结果进行定量分析，应用平均积分吸光度对CGRP及CGRPR-1表达程度进行定量检测分析，平均光度值越高，表示该部位CGRP及CGRPR-1表达越强。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 两组家兔的骨痂BMD值

造模1周后，两组家兔骨痂BMD差异无统计学意义(P>0.05)，2、3及4周后，治疗组家兔的新生骨区BMD均高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组家兔的胫骨BMD值

2.2 两组家兔的骨痂BMC值

造模1周后，两组家兔骨痂BMC差异无统计学意义(P>0.05)，2、3及4周后，治疗组家兔的新生骨区骨痂BMC高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3 两组家兔骨生物力学性能

造模4周后，三点弯曲检测结果显示，治疗组胫骨的弹性载荷、弯曲能量、断裂载荷及刚性系数比模型组明显上升(P<0.05)，见表3。

表2 两组家兔的胫骨BMC值

表3 两组家兔胫骨生物力学性能

2.4 两组家兔的新生骨组织CGRP表达

造模1周后，两组家兔新生骨组织CGRP表达差异无统计学意义(P>0.05)，2、3及4周后，治疗组家兔的新生骨组织CGRP表达均高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4及图1。

2.5 两组家兔的新生骨组织CGRPR-1表达

表4 两组家兔的新生骨组织CGRP表达

图1 造模后CGRP的阳性表达

造模1周后，两组家兔新生骨组织CGRPR-1表达差异无统计学意义(P>0.05)，2、3及4周后，治疗组家兔的新生骨组织CGRPR-1表达均高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表5及图2。

3 讨论

胫骨骨折是常见的骨折类型之一，通过外科手术可对胫骨骨折进行有效治疗，但因胫骨解剖结构独特，缺乏有效的软组织和血运保护，易造成明显骨缺损，术后患者愈合较慢，修复过程复杂[6-7]。受病情延误、伤势严重、治疗方法不当及护理失误等因素影响，胫骨骨折患者会发生骨缺损等并发症，从而造成骨折不愈合，需要进行二期手术促进其愈合，不仅增加了患者及家属的经济负担，还严重影响患者的生存质量[8-9]。本研究以新西兰兔为研究对象，其与人类骨组织代谢速率相似，造模手术时损伤组织较少，术后并发症少，可减少模型的其他影响因素，更利于研究电刺激对胫骨骨缺损家兔模型骨组织愈合的影响。

表5 两组家兔的新生骨组织CGRPR-1表达

图2 造模后CGRPR-1的阳性表达

电刺激是一种电疗方法，是将低频脉冲电流输入人体特定部位进行治疗的一种手段，具有无创伤、无痛的优点，是骨科传统的有效治疗手段之一[10-11]。本研究结果显示，造模2、3及4周后，治疗组家兔的新生骨区BMD和BMC均高于模型组。这是因为通过局部微电流刺激，可使家兔胫骨骨折区域产生各种“感应电产物”，从而有效激活成骨细胞，促进破骨细胞吸收，使骨形成大于骨吸收，利于骨形成，加快骨塑形，增加骨痂形成，促进骨修复。

骨组织的生物力学是生物物理学的一个重要分支，通过对骨组织的力学性能进行检测，可有效反应骨组织的整体性能[12-13]。本研究造模后4周，三点弯曲检测结果显示，治疗组胫骨的弹性载荷、弯曲能量、断裂载荷及刚性系数比模型组明显上升，这可能是因为经过局部微电流刺激，可刺激破骨细胞早期前提分化和增殖，促进骨吸收，加快骨重塑，增加骨痂形成速度，随着骨密度增高及骨矿物含量的增加，其力学性能测试结果也变大，从而维持骨的正常生物力学性能，最终加快骨折愈合的速度和质量[14]。

胫骨缺损的修复过程十分复杂，会受到各种因素的影响，如激素、多种细胞因子及神经肽等因素调控[15-16]。感觉神经和自主神经会分泌神经肽类物质影响骨组织的代谢，其中CGRP是影响成骨细胞及破骨细胞的关键神经肽，并可与CGRPR-1结合参与调节骨生长及骨重塑过程[17-18]。骨折愈合最根本的因素是局部血液供应，CGRP具有很强的血管调节活性，可刺激血管内皮细胞的增殖，促进血管生成，从而参与骨折早期修复及晚期塑形[19-20]。本研究结果显示，造模2、3及4周后，治疗组家兔的新生骨组织CGRPR-1表达均高于模型组。这可能是因为通过局部微电流刺激治疗，可有效刺激骨膜上丰富的感觉神经末梢纤维，提高神经元的兴奋性，增加CGRP的分泌释放，并激活胶质细胞上CGRPR-1，促进胶质细胞增殖，神经突起生长及加强轴浆运输能力，改善神经损伤后其支配区局部的血供情况，调节骨的生长、修复及改建。

综上所述，通过对兔胫骨骨缺损部位进行局部微电流刺激，可提高降钙素基因相关肽表达，促进骨缺损的愈合，改善骨痂质量。后期应用于临床治疗将促进骨缺损患者的康复，值得临床推广与应用。