ALDH1和AQP-5蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达及与病理学参数、预后的关系

王秋 林川

非小细胞肺癌(NSCLC)作为常见的肺癌类型，占肺癌的80%以上[1]。癌细胞的侵袭、转移是一个复杂的过程，也是导致患者治疗失败和死亡的主要原因之一[2,3]。随着医疗科研水平的提高，更多研究证实，疾病的发生发展及预后与机体相关蛋白指标密切相关。乙醛脱氢酶1(ALDH1)是细胞内一种参与乙醛氧化的溶质酶，在多种基因的表达、组织分化及干细胞早期分化中发挥重要作用[4]。研究表明，ALDH1在多种肿瘤细胞中呈表达上调且影响患者预后[5,6]。水通道蛋白(AQPs)是存在于具有分泌和吸收功能的上皮细胞中能够转运水的特异孔道，哺乳动物中包含多种亚型，其中AQP-5被发现在多种癌症组织中高表达，与淋巴转移及预后不良有关[7,8]。因此本研究拟分析ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC组织中的表达，并探讨其与临床病理学参数、预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2010年1月至2013年12月我院手术切除的160例经病理学证实为NSCLC患者的组织标本及其癌旁正常组织标本。所有入选患者在术前未进行放化疗和其他治疗且3年随访资料完整。160例NSCLC患者，男104例，女56例；年龄25～83岁，平均年龄(48.32±12.23)岁；参照国际抗癌联盟TNM分期标准2009版[9]：Ⅰ期患者20例，Ⅱ期患者58例，Ⅲ期患者78例，Ⅳ期患者4例；肿瘤直径<2 cm 完整70例，≥12 cm 90例；病理类型：腺癌64例，鳞癌96例；组织学分级：高分化患者16例，中分化患者120例，低分化患者24例；共有98例发生区域淋巴结转移。所有组织标本在4%中性甲醛中固定，然后常规取材石蜡包埋，用于后续免疫组织化学法检测。

1.2 抗体与试剂盒 兔抗人ALDH1多克隆抗体、兔抗人AQP-5单克隆抗体购自上海长岛生物技术有限公司，辣根过氧化物标记的羊抗兔IgG购自上海沪峰化工有限公司，链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)试剂盒购自美国Abcam公司，二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒采购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组织化学检测ALDH1、AQP-5蛋白表达 将收集的组织样本固定包埋并切片，用二甲苯和梯度乙醇脱蜡后置于柠檬酸盐缓冲液中进行修复，以充分暴露抗原决定簇。然后用3%的H2O2溶液室温下浸泡10 min，封闭，分别加稀释好的一抗4℃过夜孵育，次日冲洗干净，分别加入适量生物素标记的二抗室温孵育30 min，清洗。加适量DAB作用2～5 min后用去离子水终止反应，苏木素复染1.5～2 min，清洗后于梯度乙醇中脱水，二甲苯浸泡并干燥后用中性树胶封片，镜检观察并记录实验结果。

1.4 病理切片阳性判定标准 由两位经验丰富的病理医师对病理切片进行盲评。每张切片随机选取5个高倍镜视野(×400)在光镜下观察，用阳性细胞染色强度和阳性细胞比例来判定染色结果[10]。染色强度评分：无显色为0分，浅黄色或黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。以染色细胞的阳性比例评分<5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。上述2项积分相乘，积分0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。

1.5 随访 采用定期复查和电话相结合的方式，总生存时间(OS)为从手术至随访结束或者死亡时间。

1.6 统计学分析 应用SPSS 16.0统计软件，ALDH1、AQP-5在NSCLC组织和正常组织中表达的差异性及在腺癌与鳞癌、淋巴结是否转移组间差异性用Mann-Whitney U秩和检验；在组织病理分级、临床TNM分期组间表达的差异性用KruskalWallis H检验；等级变量之间的相关性采用Spearman相关分析；Kaplan-Meier分析ALDH1、AQP-5蛋白与NSCLC患者生存率之间的相关性；Cox回归比例风险模型分析预后影响因素，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC组织和癌旁正常组织中的表达 ALDH1、AQP-5蛋白主要表达于细胞核中，ALDH1在NSCLC组织和癌旁正常组织中阳性表达率分别为90.00%和25.00%，AQP-5在NSCLC组织和癌旁正常组织中阳性表达率分别为93.75%和17.50%，NSCLC组织中ALDH1和AQP-5阳性表达率明显高于癌旁组织(P<0.001)。见表1，图1。

表1 ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC组织和癌旁正常组织中的表达 n=160，例

图1 ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC组织和癌旁正常组织中的表达(×400)

2.2 ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC组织中表达的相关性 Spearman相关分析结果显示ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC组织呈明显的正相关关系(r=0.538，P<0.001)。见表2。

表2 ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC组织中表达的相关性 例

2.3 ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC临床病理分组中表达的差异 ALDH1、AQP-5蛋白表达在腺癌和鳞癌间无统计学意义(P>0.05)，而在分化程度、TNM分期和淋巴结是否转移间存在统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC临床病理分组中表达的差异 例

2.4 ALDH1、AQP-5蛋白表达与NSCLC患者生存分析 84例ALDH1表达强度为++/+++的NSCLC患者，中位生存时间为18.5个月，76例CDK4表达强度为-/+的NSCLC患者，中位生存时间为39.4个月，ALDH1表达强度为-/+的NSCLC患者较表达强度为++/+++的NSCLC患者的生存时间明显延长，差异有统计学意义(P=0.0018)；72例AQP-5表达强度为-/+的NSCLC患者，中位生存时间为40.5个月，88例AQP-5表达强度为++/+++的NSCLC患者，中位生存时间为21.7个月，AQP-5表达强度为-/+的NSCLC患者较表达强度为-/+的NSCLC患者的生存时间明显延长，差异有统计学意义(P=0.0224)。见图2。

图2 ALDH1、AQP-5蛋白表达与NSCLC患者生存分析

2.5 Cox比例风险回归模型分析影响NSCLC临床预后的因素 单因素回归分析显示：分化程度、TNM分期、淋巴结是否转移及ALDH1与AQP-5的表达是影响NSCLC临床预后的因素(P<0.05)；对以上影响NSCLC预后的因素进行多因素回归分析，结果显示TNM分期、ALDH1和AQP-5表达是影响NSCLC预后的风险因素。见表4。

表4 Cox比例风险回归模型分析影响NSCLC临床预后的因素

3 讨论

肺癌是临床最为常见的肿瘤之一，由于发病比较隐匿，在早期并没有特殊的症状，所以确诊时一般多属中期或者晚期，已经不能进行手术切除或者局部放疗，且其预后较差[11]，给患者的家庭和社会均带来沉重的负担，因此寻找新的肿瘤标志物，及早诊断及早治疗成为科研工作者探寻的热点。

ALDH1在人类细胞表达于胞质中，基因位于9q21 染色体上，是ALDH 家族成员之一。ALDH溶质酶在代谢过程中能将醛类氧化为相应的羧酸从而解除机体毒素，主要底物视黄醛在ALDH的催化下可以氧化为维甲酸以调控基因表达及细胞分化。ALDH1蛋白近年来已陆续被发现可作为多种肿瘤干细胞标志物，如胰腺癌、乳腺癌、胃癌及卵巢癌等[12,13]。本研究结果显示ALDH1在NSCLC组织中阳性表达率为90.00%，明显高于癌旁正常组织，提示ALDH1有望作为肿瘤标志物为NSCLC的诊治提供指导。另外ALDH1的阳性表达与NSCLC的分化程度、TNM分期和淋巴结转移相关，表明ALDH1表达呈阳性的患者，分化程度低，TNM分期高且易于转移，从而促进NSCLC病程进展，使肿瘤恶性程度高，侵袭和转移能力强。AQP-5广泛分布于多种细胞中，该基因在人类位于12q3染色体上，AQP-5蛋白分子量大小21～24，其作用主要是转运水分子，维持机体水分平衡并参与调节生理活动。AQP-5的高丰度表达在细胞周期中发挥重要作用，能够促进增殖抑制凋亡[14]。研究表明AQP-5与多种恶性肿瘤的发生发展关系密切，在结肠癌和直肠癌组织中的表达明显高于正常组织[15]，本研究结果显示AQP-5蛋白主要表达于细胞核中，癌组织中表达明显高于正常组织，在分化程度、TNM分期和淋巴结是否转移间存在统计学意义，即AQP-5表达与分化程度呈负相关，而与TNM分期和淋巴结转移呈正相关，提示AQP-5高表达和NSCLC细胞侵袭、易发生转移和预后较差等特点相关，可以作为评价NSCLC发生发展的指标。本研究还发现ALDH1和AQP-5在NSCLC组织中呈明显的正相关关系，进一步的说明ALDH1过表达能够促进NSCLC细胞增殖，也可作为评价NSCLC发生发展的指标。生存分析结果显示ALDH1和AQP-5表达强度为-/+的NSCLC患者中位生存期较表达强度为++/+++的患者明显延长，差异具有统计学意义。提示ALDH1和AQP-5过表达均能明显降低NSCLC患者的生存期，Cox分析结果显示ALDH1和AQP-5均是影响NSCLC预后的风险因子，提示ALDH1和AQP-5会促进NSCLC的发生发展。

综上所述，ALDH1和AQP-5过表达可促进NSCLC的发生发展，降低NSCLC患者的生存期，联合监测ALDH1和AQP-5的表达对NSCLC的发生发展有一定的临床价值。