泥蚶抗菌物质的制备及其抗菌活性分析

刘 芳，陈慧玲，林宏宇

（宁德师范学院 生命科学学院，福建 宁德 352100 ）

宁德二都盛产贝类，当地盛产的泥蚶(Arca granosa) 因味道鲜美，被称为“二都蚶”.泥蚶肉质细嫩有弹性，因富含血红蛋白，故肉色鲜红，热水焯烫30 s 后即可鲜食，也可酒渍后食用，或晒制成干品.泥蚶隶属于软体动物门，具有药用价值，传统中医认为泥蚶的壳具有消痰化瘀、制酸止痛的功效[1].研究表明，蚶肉中的蛋白质类化合物是其主要的药效成分[2]，其药效作用主要有抗癌、抗肿瘤、抗疲劳等.姚如永等[3-4]从泥蚶中分离出了具有抗肿瘤作用的海生素，张永娟等[5]研究发现泥蚶总蛋白具有抗疲劳作用，Ma 等[6]研究了抗菌肽（antimicrobial peptide，AMP）成为有效抗癌肽（anticancer peptides,ACP）的理化参数.

抗生素滥用导致食品中抗生素残留、超级细菌出现、人体耐药性提高等多种问题，开发安全、高效的抗生素替代品显得尤为重要，从生物体内获得天然的抗菌物质则是一个重要的研究方向.目前发现的难以产生耐药性、安全的抗生素替代品主要有抗菌肽、寡聚糖、益生菌等，其可用于食品、饲料、医药等多种产品中.蚶肉中含有丰富的蛋白质和多肽，从蚶中分离出的活性蛋白及肽类已有约30 多种[2]，而目前关于泥蚶的抗菌肽研究较少.王素芳等[7]从泥蚶中分离纯化出2 种血红蛋白（Tg-HbⅠ和Tg-HbⅡ），且均对大肠杆菌和恶臭假单胞杆菌具有抗菌活性.王娟娟等[8]对泥蚶血红蛋白酶解多肽的抗菌活性的研究结果表明，泥蚶多肽对副溶血弧菌、溶藻弧菌和哈维氏弧菌具有明显抗菌活性.柯佳颖等[9]通过研究泥蚶凝集素的抑菌作用表明，凝集素对金黄色葡萄球菌具有一定的抗菌活性.杨婷婷[10]对泥蚶血红蛋白及其多肽的抗菌功能的试验结果表明，泥蚶血红蛋白HbⅠ（血红蛋白同源二聚体Ⅰ）、Hb II（血红蛋白异源四聚体II）对大肠杆菌的MIC 分别为0.125 和0.375 mg·mL-1，对枯草芽孢杆菌的MIC 分别为6.25×10-3和4.69×10-3mg·mL-1，说明泥蚶血红蛋白及其酶解多肽均具有不同程度的体外抗菌活性.Samaneh 等[10]通过研究水解黄鳍金枪鱼副产物所制得的抗菌肽的抗菌活性，发现该抗菌肽对李斯特菌、葡萄球菌、大肠埃希菌和假单胞菌有一定的抗菌和抗氧化活性，并认为该抗菌肽可在营养保健品和功能性食品中用作抗菌和抗氧化剂成分.

以上研究表明，泥蚶中存在抗菌活性物质.因此，本研究以宁德二都地区盛产的泥蚶的软组织为原料，通过酶解法制备抗菌物质，研究其最佳酶解参数，旨在探索海洋生物资源新物质，以期为推进海洋生物制品新产品的研究与开发提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料

宁德二都泥蚶（购于宁德新华都购物广场有限公司）、中性蛋白酶（Ruibio 公司）、大肠杆菌由宁德师范学院生命科学学院刘盛荣博士实验室提供.

1.2 试验设备

T6 新世纪紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、B-400 型均质机（瑞士步琦）、YB-FD-18 型冷冻干燥机（上海亿倍实业有限公司）、SW-CJ-1FD 型超净工作台（苏州苏净安泰空气技术有限公司）、DHP-9272A 型电热恒温培养箱（上海飞跃试验仪器有限公司）、麦氏比浊管（温州康泰生物科技有限公司）等.

1.3 试验方法

1.3.1 抗菌物质的制备工艺 将新鲜的泥蚶洗净、吐净泥沙后取软组织，用75%酒精消毒，加入适量无菌水匀浆，用中性蛋白酶在适宜条件下酶解，酶解结束后，迅速在95 ℃下水浴灭酶10 min，然后置于4℃、4 000 r·min-1条件下离心30 min，取上清液，减压浓缩，冻干，得泥蚶抗菌物质冻干粉.

1.3.2 抗菌活性测定 采用比浊法测定抗菌活性[12-13].在3 个无菌三角瓶中分别加入25 mL 液体培养基，4 mL抗菌物质液体，1 mL 菌悬液（菌浓度1×104CFU·mL-1），以不加抗菌物质的三角瓶作为对照，充分混匀，将试管放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h 后，用紫外-可见光分光光度计在600 nm 波长处测定培养液的吸光值.

1.3.3 单因素试验 采用单因素试验，以抗菌活性为指标，研究酶解pH 值、温度、时间、料液比对酶解法制备泥蚶抗菌物质的影响.

pH 值的选择：酶解时间为3 h，温度50 ℃，料液比1∶5，酶添加量为6 000 U·g-1，设置pH 值梯度为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，酶解后测定抗菌物质的抗菌活性，每个水平重复3 次.

温度的选择：酶添加量为6 000 U·g-1，料液比为1∶5，溶液的pH 值为7.0，酶解时间为3 h.将酶解温度设置为30、40、50、60、70 ℃5 个梯度，酶解后测定抗菌物质抗菌活性，每个水平重复3 次.

时间的选择：温度为50 ℃，提取液的pH 值为7.0，料液比为1：5，酶添加量为6 000 U·g-1，设置时间梯度为1、2、3、4、5 h，酶解后测定抗菌物质的抗菌活性，每个水平重复3 次.

料液比的选择：温度为50 ℃，pH 值为7.0，酶添加量为6 000 U·g-1，酶解时间3 h；设置料液比梯度为1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7，酶解后测定抗菌物质的抗菌活性，每个水平重复3 次.

1.3.4 正交试验 为了进一步优化酶解条件，在单因素结果的基础上采用4 因素3 水平正交试验对酶解pH 值、温度、时间、料液比条件进行优化，以得到最佳酶解条件.试验设计见表1.采用Minitab16 对正交试验数据进行处理.

表1 正交试验设计表

2 结果与分析

2.1 pH 值对抗菌活性的影响

图1 反应了在不同pH 值环境下，中性蛋白酶作用于泥蚶软组织后制备的抗菌物质的抗菌活性.对照组的吸光值为0.731，试验组的吸光值均低于对照组，说明制备的抗菌物质对大肠杆菌具有抗菌活性.当pH 值过低或过高，抗菌活性均相对较差，这可能是由于过低或过高的pH 值环境降低了酶的活性或者使酶失活，导致不能充分酶解泥蚶软组织，无法释放泥蚶蛋白质中的活性肽段.当pH 值为7.5 时OD600最低，抗菌活性最佳.

图1 不同pH 值环境制备的抗菌物质对大肠杆菌的抗菌活性

2.2 温度对抗菌活性的影响

温度过高或过低均对酶活性有影响，而且过高的温度会使酶变性失活，过低的温度使酶解反应速率过低，故合适的酶解温度非常重要.由图2 可知，试验组的吸光值均低于对照组，当温度在40～60 ℃范围内，多肽的抗菌活性均相对较高.当温度为50 ℃时，抗菌活性最佳.

图2 不同酶解温度制备的抗菌物质对大肠杆菌的抗菌活性

2.3 时间对抗菌活性的影响

由图3 可知，酶解时间的长短影响抗菌物质对大肠杆菌的抗菌活性，当酶解时间为3 h 时，抗菌活性最佳.时间短，酶和蛋白质反应不够充分，无法充分释放泥蚶组织中的抗菌物质；时间过长，泥蚶软组织中的蛋白质会被水解过度为氨基酸，因此有必要选择合适的酶解时长.

2.4 料液比对抗菌活性的影响

料液比反应了底物浓度对酶促反应的影响，合适的底物浓度有利于酶促反应的进行.由图4 可知，当料液比为1∶5 至1∶7 时，抗菌活性较好；当料液比为1∶6 时，抗菌活性最佳.

2.5 正交试验设计与结果分析

根据单因素试验结果，采用正交试验对酶解条件进一步优化，试验结果见表2.根据表2 可知，从抗菌活性来看，4 个因素的影响主次顺序为pH 值＞温度＞时间＞料液比.优组合为A1B2C3D2，即pH 值为7.0，温度为50 ℃，酶解时间为4 h，料液比为1∶6.该组合不在正交试验表中，经3 次验证性试验，结果表明该组合的抗菌活性平均值为0.358，低于正交试验中不同酶解条件下制备的抗菌肽的抗菌活性.

图3 不同酶解时间制备的抗菌物质对大肠杆菌的抗菌活性

图4 不同料液比制备的抗菌物质对大肠杆菌的抗菌活性

表2 正交试验结果

3 讨论

抗菌肽广泛存在于细菌、病毒和各种动植物体内，是一种具有抗菌活性的小分子肽[14].因其不易使微生物产生抗药性、大部分对宿主无害等优点受到关注.但因从天然材料中提取抗菌肽工艺复杂、成本昂贵，化学合成成本高，基因工程表达载体构建难，产量低等多种问题[15]，采用酶解法水解生物蛋白质，释放生物体内蛋白质中具有抗菌活性的肽段，成为人们常用的研究方法.本研究表明，泥蚶软组织最佳酶解条件为pH 值7.0，酶解温度50 ℃，酶解时间4 h，料液比1∶6，此条件下制备的抗菌肽具有一定的抗菌活性.相较于王素芳等[7]、王娟娟等[8]直接利用泥蚶的血液提取抗菌物质，本研究不局限于泥蚶血液，而是采用了泥蚶的全部软体组织，通过酶解法释放蛋白质中具有抗菌活性的多肽，可获得抗菌物质的范围更广.本研究重在初步探索海洋生物资源新物质，有助于推进海洋生物制品新产品的研究与开发，但尚处于探索阶段，有待进一步深入研究.