气相色谱内标法测定白酒中乙酸乙酯含量的不确定度评定

左惠君，都 芸，左惠芸，邱怡筠，张露月

（1.烟台市食品药品检验检测中心，山东烟台 264000；2.江南大学生物工程学院，江苏无锡 214122）

测量不确定度可以合理地表征被测量值的分散性[1]。通过测量不确定度可以了解到被测量值在什么范围内，同时还可以定量说明一个实验室的检验能力水平[2-3]。RB/T 214—2017《检验检测机构资质认定能力评价检验检测机构通用要求》[4]中明确规定检验检测机构应根据需要建立评定测量不确定度的程序，在出现临界值、内部质量控制或客户要求时，应报告检验项目的测量不确定度[5]。由此可见，测量不确定度的评定对于检验检测机构保证所出具数据的准确性和可靠性是十分重要的[6]。

酯类物质是形成白酒香气的主要成分，可在不同程度上增加酒的香气并决定香气的品质。白酒中的酯类物质一部分是酵母菌、细菌、霉菌的胞内代谢产物，一部分来源于发酵后期酸和醇在酿酒微生物的作用下的酯化反应，是形成酒体不同香气和不同浓郁程度的主要因素[7-9]。乙酸乙酯是构成清香型白酒主体复合香气的主要物质。它的含量对判定清香型白酒的品质和质量等级有很重要的意义，也是实验室中最常检测的理化项目之一[10-12]。本文参照国家标准GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[13]，采用气相色谱内标法测定清香型白酒中乙酸乙酯含量。并按照JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》[14]对测量结果进行不确定度分析，通过数学模型的建立系统分析了各不确定度来源，并对各个分量进行评估和合成，为清香型白酒的质量控制和检验检测结果评定提供一定的参考和指导。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器

样品：市售白酒样品。

仪器设备：Agilent 7890B 型气相色谱仪配FID检测器，美国安捷伦科技有限公司；AR224CN 型万分之一精密分析天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司；10～100 μL 可调量程移液器，Eppendorf 艾本德中国有限公司。100 mL、10 mL A 级容量瓶、1 mL A 级单标吸量管，天津市天科玻璃仪器制造有限公司。

1.2 标准溶液的配制

a.乙酸乙酯储备液[2 %（v/v）]配制：用天平准确称量2 mL 乙酸乙酯（色谱纯）于100 mL 量瓶中（准确至0.000 1 g），用60%乙醇溶液定容至刻度，标准品浓度为c储。

b.内标乙酸正戊酯溶液[2 %（v/v）]：吸取乙酸正戊酯（色谱纯）2 mL，用60 %乙醇溶液定容至100 mL，浓度为c内0。

c.混合标准溶液：吸取乙酸乙酯储备液1.00 mL移入100 mL 容量瓶中，加入内标溶液1.00 mL，用60%乙醇溶液稀释至刻度。

1.3 测定步骤

气相参数调至最佳，稳定后混合标准溶液进样6 次，以乙酸乙酯与乙酸正戊酯（内标）峰面积比的平均值做校正因子f。

吸取样品10.0 mL 于10 mL 容量瓶中，加入内标溶液100 μL，混匀后，在与f 值测定相同的条件下进样，测定，做6 个平行。其中，第1 个平行样品进样6次，计算样品峰面积比测量重复性，以前2次测定平均值为1 号样品测得值，后5 个样品只平行测定2 次，测定平均值为样品测得值。检测流程图见图1。

图1 检测流程图

2 测量模型及测量不确定度分析

根据内标法原理，标准溶液校正因子：

样品中乙酸乙酯的计算公式：

I为内标在样品中的浓度：

式中：c标——混合标准溶液中乙酸乙酯的浓度，g/L；

c内——混合标准溶液中内标乙酸正戊酯的浓度，g/L；

A标——混合标准溶液中乙酸乙酯的峰面积；

A内——混合标准溶液中内标乙酸正戊酯的峰面积；

c储——配制的乙酸乙酯储备液的浓度，g/L；

c内0——配制的内标乙酸正戊酯溶液的浓度，g/L；

v标——配制混合标准溶液时乙酸乙酯吸取体积，mL；

v内——配制混合标准溶液时内标乙酸正戊酯吸取体积，mL；

v定——混合标准溶液的定容体积，mL；

A样——酒样中乙酸乙酯的峰面积；

A内-样—酒样中内标乙酸正戊酯的峰面积；

v样——吸取酒样的体积，mL；

v内-样——酒样中加入内标乙酸正戊酯溶液的体积，mL。

将公式（1）（2）（4）代入公式（3）得：

可得测量模型，X=F（c储，v标，v内，v内-样，v样，

由此可知，样品中乙酸乙酯测量结果不确定度主要来源于乙酸乙酯标准储备溶液浓度、配制混合标准溶液时吸取乙酸乙酯标准储备溶液体积及内标乙酸正戊酯溶液的体积、吸取样品体积及加入内标溶液体积、校正因子测定时乙酸乙酯和内标峰面积比以及样品中乙酸乙酯和内标峰面积比这7 部分。与内标乙酸正戊酯储备液浓度、混合标准溶液定容体积及样品加内标后体积之和都无关，这也是内标法的特点之一，这3 个因素可不予评定。根据测量模型，各不确定度分量分析因果图见图2。

3 不确定度评定

3.1 测量重复性

按照标准要求对一酒样中的乙酸乙酯进行6次测定，测定结果见表1。

表1 酒样中的乙酸乙酯测定结果

测量重复性不确定度：

3.2 乙酸乙酯标准储备溶液引入的不确定度

乙酸乙酯标准储备溶液不确定度主要是由标准品的纯度、标准品的称量质量、定容体积引入。

3.2.1 乙酸乙酯标准品纯度P的不确定度

乙酸乙酯标准品证书表明，质量分数P=99.7%，U=0.2%，K=2。

纯度P的相对不确定度为：

图2 不确定度分量分析因果图

3.2.2 乙酸乙酯标准品称量质量m的不确定度

乙酸乙酯储备液配制时，用万分之一天平进行了两次称量，称量得2 mL 乙酸乙酯标准溶液质量m 为1.8657 g。查天平检定证书可知，天平的重复性标准偏差为0.2 mg，天平的重复性为极差，用极差系数C（6次）=2.53求标准偏差[14]。

称量引起的相对不确定度为：

3.2.3 乙酸乙酯标准品定容体积引入的不确定度

乙酸乙酯标准品的定容使用的是A 级100 mL容量瓶，按照检定规程其最大允差为±0.10 mL[15]，按照均匀分布，其不确定度为：=0.0577 mL。

定容过程中，温度波动也会对定容体积造成影响。根据《新编酒精密度浓度和温度常用数据表》[16]中表Ⅱ“酒精溶液密度与温度和体积浓度关系表”，60%vol酒精在20 ℃左右的密度见表2。

表2 60%vol酒精在不同温度下的密度

根据表2 计算得60%vol 酒精溶液体积膨胀系数:8.8×10-4/℃，明显大于玻璃的膨胀系数。实验室环境温度变化为20 ℃±2 ℃，温度波动按均匀分布k=，故温度变化引起的不确定度为：

合成100 mL容量瓶引起的相对不确定度：

综上，合成乙酸乙酯标准储备溶液引入的相对不确定度为：

3.3 配制混合标准溶液时，吸取乙酸乙酯储备液1.00 mL及加入内标溶液1.00 mL引入的不确定度

实验室使用A 级1 mL 单标吸量管，最大允差为±0.007 mL[15]，按照均匀分布，其引入的相对不确定度为ur(V标)=ur(V内)==0.00404。

3.4 酒样测定时取样量和加入内标溶液引入的不确定度

酒样取样采用A 级10 mL 单标吸量管直接取样，其最大允差为±0.020 mL[15]，因此按照均匀分布，酒样取样量引入的相对不确定度为：

向酒样中加入100 μL 内标溶液是使用100 μL移液器，根据JJG 646—2006[17]可知，其量取100 μL时容量允许误差为2%，可直接按均匀分布得出相对不确定度，加入内标溶液引入的相对不确定度为：

3.5 混合标准溶液中乙酸乙酯和内标峰面积比重复性引入的不确定度

气相色谱仪器的重复性会对每次测量结果的准确性产生影响，因此校正因子测定时由此引入的不确定度应考虑在内[18-19]。本次测定使用的内标法，可以消除进样体积、操作条件波动等很多因素的影响[20-21]，因此单纯采用气相色谱仪检定报告中的重复性数据并不能真实表达这一不确定度分量。所以，在此次研究中，将峰面积比作为一个整体，通过平行测定实验结果来计算不确定度。配制好加入内标溶液的混合标准溶液后，待色谱仪基线稳定，用自动进样器进样，平行测定6 次，记录乙酸乙酯和内标峰的峰面积，用其比值计算出校正因子，结果见表3。

表3 校正因子测定时乙酸乙酯和内标峰面积比

表4 样品中乙酸乙酯和内标峰面积比

3.6 样品测定时乙酸乙酯和内标峰面积比重复性引入的不确定度

吸取样品加入内标溶液混匀后，在与校正因子f 值测定相同的条件下用自动进样器进样，测定。第1 个样品平行进样6 次，计算其重复性，以前2 次测定平均值为1 号样品测得值。结果见表4。

实验过程中，一个样品一般平行测定两次，以前2 次平均值7.6466 计算，2 次测量重复性相对不确定度为0.00091。

3.7 合成标准不确定度

由评定过程可知，各不确定度输入量之间相互独立，因此，合成相对标准不确定度为：

合成标准不确定度为：

u(X)=ur(X)×X=0.0131×2.42=0.032 g/L。

3.8 扩展不确定度及不确定度报告

取包含因子k=2，扩展不确定度U=k×u(X)=2×0.032=0.064≈0.07 g/L

白酒中乙酸乙酯含量的结果：X=（2.42±0.07）g/L；k=2，各类相对不确定度主要分量及贡献见图3。

图3 各不确定度分量值图

4 结果与讨论

采用气相色谱内标法测定清香型白酒中乙酸乙酯含量，并对测量结果进行不确定度分析，得出该测定方法的扩展不确定度为0.064 g/L。通过内标法测量模型推算可知，样品中乙酸乙酯的含量测定与内标储备液浓度无关，与混合标准溶液定容体积无关，与样品加内标后体积之和无关。

从图3 可看出，由体积所引起的不确定度是影响乙酸乙酯含量测量不确定度的主要因素，其他不确定度分量大致相当。用100 μL 移液器向酒样中加入内标溶液时引入的相对不确定度为0.0115，是最大的影响因素。近年来，移液器由于方便快捷而在实验室普遍使用，这也提醒我们对移液器的规范使用和定期检定维护是十分重要的。根据内标法的特点，以峰面积比为整体进行评定可以看出气相色谱仪的重复性对测定结果的影响还是比较小的，这也是内标法定量相较于外标法定量的优势之一。总之，在严格按照标准操作的基础上，选用精度高的计量器具是降低不确定度很好的途径。