PD 小鼠模型应用硫辛酸对自噬蛋白表达水平的影响

魏涛 范小娟2

（1 徐州医科大学公共实验研究中心 221000 2 江苏省军区徐州第三离职干部休养所门诊部 221000）

帕金森（PD）为中老年人常见的神经系统变性疾病，可累及神经、精神、运动系统损伤，诱发脑部病变，严重危害患者身体健康[1]。目前，临床上尚未明确PD 发病机理，但可能与线粒体功能异常、自噬作用、细胞凋亡、氧化应激等有关[2]。国内外诸多研究证实[3-4]，线粒体自噬在保持神经元活性、神经细胞功能完整性方面具有重要作用。为进一步了解硫辛酸对PD 小鼠自噬蛋白表达水平的影响，现对80 只健康7 周龄雄性小鼠展开研讨，具体如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

仪器与材料：LSM710 型激光共聚焦显微镜（德国蔡司公司），58404R 型高速台式离心机（德国艾本德公司)。

免疫组化检测试验盒、BCA 蛋白测定试剂盒、PINK1 抗体、DJ-1 单克隆抗体、Parkin 单克隆抗体、MPTP 分别来自于上海莼试生物技术有限公司、北京市艾德莱生物科技有限公司、巴傲得生物科技有限公司、上海康朗生物科技有限公司、艾美捷科技有限公司、四川宇康生物技术有限公司、珠海市泛海生物技术有限公司、上海仁捷生物科技有限公司。

实验动物：80 只健康7 周龄雄性小鼠（徐州医科大学动物中心）。

1.2 方法

（1）分组方法：以抓阄法把80 只小鼠均分成四组，即PD模型组、预保护组、研究组、正常对照组。

（2）模型制作：以MPTP 背部皮下注射方式，制备PD 小鼠模型。用背部皮下注射给药方式予以研究组、预保护组、PD模型组MPTP25mg/kg，每周2 次，连续治疗5 周。造模前，用以上同样给药方式给予预保护组a-硫辛酸60mg/kg；造模后，予以研究组a-硫辛酸60mg/kg，持续注射2 周。正常组不给予任何处理。

（3）行为学评分：在MPTP 用药后，查看小鼠活动状况。药物注射3min 内，小鼠便出现全身抽搐、鼠尾与毛竖起、易激怒、抓鼻、步态蹒跚等反应，10～20min 后恢复至正常，即可判定模型制作成功。

（4）悬挂实验：用金属丝把小鼠挂到实验台上，高度控制为30cm，统计从悬挂到落地时间，并进行评分，其中，0～4s 即为0 分，5～9 分即为1 分，10～14s 即为2 分，15～19s 即为3 分，20～24s 即为4 分，25～29s 即为5 分，≥30s 即为6 分。

（5）爬杆实验：自制爬杆，将小鼠头向上放于顶部，统计小鼠从一开始运动到彻底转变为头朝下运动时间与抵达杆底的时间和。测试前，先训练小鼠爬杆约5 次，再次测量5次，取其平均值，每次测试间隔时间控制为1min。

（6）以Western blotting 法测定DJ-1、Parkin、PINK1、TH：在行为学判断后开展检测。利用0.1mg/g10%水合氯醛实施腹腔注射，以完成深度麻醉；行断头操作，然后，于冰上实施开颅取脑，彻底洗净残余血液，把黑质纹状体分离，并剪碎组织，将其与组织分解液充分混合，4℃下，离心，取上清液放于-80℃下保存备用。蛋白定量后，分装，保证蛋白浓度相同；待添加等体积上样缓冲液后，沸煮5min。之后，添加一抗，在4℃条件下孵育1 夜；洗膜后，将二抗加入，孵育（37℃）2h，再次洗膜。利用ECL 进行显色，将显影曝光，以Iamage lab 软件对各蛋白表达情况进行分析。

以免疫组化法测定小鼠DJ-1、Parkin、纹状体PINK1、黑质TH：待开展行为学评定后，采用10%水合氯醛实施麻醉，将心脏暴露，将静脉留针穿入左心室，打开右心房，将生理盐水注入左心房，用多聚甲醛进行灌注，断头取脑后，固定。梯度脱水，石蜡包埋，实施连续切片。选取小鼠纹状体、黑质不重叠的4 倍视野4 个，在显微镜作用下观测组织微观结构变化状况，统计阳性细胞数。阳性判定标准：细胞核表现为紫蓝色或浅蓝色，细胞浆表现为棕黄色。

1.3 统计学分析

用统计学软件SPSS24.0 处理数据，计量资料（ ）以F检验，P＜0.05，即差异显著。

2结果

2.1 4 组小鼠悬挂时间与爬杆时间对比

PD 模型组、预保护组、研究组悬挂时间均短于正常对照组，爬杆时间均长于正常对照组（P＜0.05）。PD 模型组悬挂时间均短于预保护组、研究组，爬杆时间均长于以上两组（P＜0.05），见表1。

表1 4 组小组悬挂时间、爬杆时间对比（，s）

表1 4 组小组悬挂时间、爬杆时间对比（，s）

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2.2 4 组Western blotting 法检测结果对比

较正常对照组，其他三组DJ-1、Parkin、PINK1、TH 水平下降（P＜0.05）。PD 模型组DJ-1、Parkin、PINK1、TH 水平均低于预保护组、研究组（P＜0.05），见表2。

2.3 4 组免疫组化法检测结果对比

相比于正常对照组，其他三组DJ-1、Parkin、PINK1 阳性神经元数较少（P＜0.05）。PD 模型组DJ-1、Parkin、PINK1 阳性神经元数均少于预保护组、研究组（P＜0.05），见表3。

3 讨论

近年来，跟随着神经元变性的深入研究，发现PD 治疗药物组间失去效价与有效性，故而，临床上需改变治疗方案。限制药物应用的重要原因为运动障碍等不良反应。硫辛酸属生物膜成分，在动植物体内均可见。二硫代脂肪酸为硫辛酸还原形式，其可预防及避免氧化应激。二硫代脂肪酸与硫辛酸属于天然抗氧化剂，为脱氧酶辅助因子，均可整合脑中金属离子，增加维生素C、E 含量，减轻脑组织损伤，减少膜电位损伤量，提高相关酶活性，故而，就线粒体营养物而言，硫辛酸能起到靶向作用。在PD 常规药物治疗中，硫辛酸能有效减轻因抗PD 所引起的不良作用，进而提升患者运动功能与生活质量。鉴于此，可将硫辛酸作为PD 的新型方式。

表2 4 组Western blotting 法检测结果对比（）

表2 4 组Western blotting 法检测结果对比（）

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PINK1 常见于Parkin 上游，在机体线粒体功能受到损伤时，其能促使Parkin 蛋白活化，诱导吞噬反应。而Parkin 水平的下降，可造成线粒体断裂，降低细胞对钙离子的处理能力，增加对应激易感性。除氧化作用之外，DJ-1 也可诱发自噬反应。DJ-1 主要通过对Nurrl 的激活、上调多巴胺，改善TH 基因表达情况。DJ-1 缺失为造成自噬标志物堆积与线粒体表型的主要原因。所以，DJ-1 蛋白功能障碍能导致神经元损伤，从而诱发PD。研究中，四组悬挂时间、爬杆时间相比，存在明显差异，其中，正常对照组悬挂时间最长，爬杆时间最短，PD 模型组悬挂时间最短，爬杆时间最长，这提示PD 模型制备成功，能有效保证后期实验开展的有效性。四组DJ-1、Parkin、PINK1、TH 水平相比，正常对照组均最高，PD模型组均最低，这表示硫辛酸能改善PD 小鼠DJ-1、Parkin、PINK1、TH 表达水平。四组DJ-1、Parkin、PINK1 神经元数相比，正常对照组均最高，PD 模型组均最少，这说明硫辛酸能对PD 小鼠神经元具有一定保护作用。

表3 4 组免疫组化法检测结果对比（，个/4 倍视野4 个）

表3 4 组免疫组化法检测结果对比（，个/4 倍视野4 个）

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综上，硫辛酸对PD 小鼠自噬蛋白表达水平可起到一定调节作用，有助于其病情控制。