miR-21-5p抑制缺氧诱导的肺动脉内皮细胞损伤

崔艳红，刘培培，孙潺

（南阳市中心医院呼吸内科二病区，南阳 473000）

肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一种极具破坏性且能危及生命的疾病，其特征是肺血管阻力和肺动脉压的持续增加，并导致右心功能障碍[1]。虽然已提出了许多假说，但目前PAH进展的具体调控机制仍不明确。近来研究表明，慢性缺氧是PAH患者血管重构的重要刺激因素[2，3]，低氧诱导的肺动脉内皮细胞（pulmonary artery endothelial cell，PAEC）损伤在PAH的血管重构中发挥重大作用[4，5]。然而，影响PAEC损伤反应中涉及的具体分子机制仍不完全清楚。

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一类长度约为21～23个核苷酸的小的非编码单链RNA分子，其可通过与特定mRNA靶标的3’-非翻译区（untranslation region，UTR）相互作用而在转录后下调基因表达[6]。miRNAs在胚胎发育、细胞增殖、迁移、凋亡和免疫应答等多种生物过程中起调节作用[6，7]。生物信息学预测表明30%以上的基因受miRNA调控[7]。在慢性缺氧和野百合碱诱导的PAH大鼠模型中，已经明确指出众多miRNAs参与调控PAH的进展[8]。miR-21-5p作为miRNAs的一员，其已被证明是包括肿瘤细胞、内皮细胞和平滑肌细胞在内的许多细胞类型的缺氧敏感性标记物[9，10]。目前，miR-21-5p在缺氧导致的PAEC损伤中的主要功能尚不清楚。因此，本研究通过构建缺氧刺激诱导的HPAEC损伤模型研究miR-21-5p的功能，并阐述其中涉及的分子机制。

材料和方法

1 主要试剂与材料

DMEM培养基和胎牛血清（Gibco公司）；L-谷氨酰胺、内皮细胞生长添加剂（endothelial cell growth supplement，ECGS）、肝素钠和脂质体Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）；miR-21-5p模拟物（miR-21-5p mimic）和miR-21-5p的阴性对照物（miR-NC）（上海万生昊天生物技术有限公司）；Krüeppel样因子6（Krüeppel-like factor 6，KLF6）过表达载体质粒（pcDNA-KLF6）和对照载体质粒（pcDNA-Con）（上海生工生物工程股份有限公司）；Hoechst 33342染液、Trizol试剂和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）检测试剂盒（北京索莱宝生物技术有限公司）；FastKing一步法反转录-荧光定量试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）；Annexin V-FITC/PI试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；Bradford法蛋白定量试剂盒、RIPA裂解液、兔抗GAPDH抗体、小鼠抗β-actin抗体和辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）偶联的山羊抗兔或驴抗小鼠IgG (H+L)二抗（武汉博士德生物工程有限公司）；小鼠抗Cleaved caspase-3和小鼠抗KLF6抗体（Santa Cruz Biotechnology公司）；原代人肺动脉内皮细胞（HPAEC）（上海中乔新舟生物科技有限公司）。

2 细胞培养

原代HPAEC培养在含有20%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 μg/mL ECGS和20 μg/ml肝素钠的DMEM培养基中，置于5% CO2的潮湿的细胞培养箱中。待细胞传代至于第5～8代时用于后续实验。

3 细胞缺氧处理

取第5～8代HPAEC至于Forma 3130型缺氧细胞培养箱（美国Thermo Scientific公司）（培养条件为37 °C、5% CO2、90% N2和5% O2）中分别培养12、24和48 h。

4 细胞转染

取第5～8代HPAEC置于不含抗生素但含20%胎牛血清2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 μg/ml ECGS和20 μg/mL肝素钠的DMEM培养基中，待细胞生长至约70%～80%汇合时，更换无血清培养基培养6 h，用Lipofectamine 2000试剂分别将miR-NC、miR-21-5pmimic、pcDNA-Con和pcDNA-KLF6转入HPAEC，孵育6 h后更换正常培养基继续培养48 h。

5 RT-qPCR

用Trizol试剂提取细胞总RNA，然后按照说明书步骤用FastKing一步法反转录-荧光定量试剂盒在SLAN-96P型实时荧光定量PCR系统（上海宏石医疗科技有限公司）中进行反应。引物序列为：5′-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3′（miR-21-5p正向引物）；5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(U6，正向引物)，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′ (U6，反向引物)。以U6作内部对照，用2-ΔΔCt法计算其miR-21-5p相对表达量。

6 LDH活性检测

将已转染miR-NC、miR-21-5p-mimic、miR-NC+ pcDNA-Con、miR-21-5p-mimic+pcDNA-Con、miR-21-5p-mimic+pcDNA-KLF6的HPAEC分别接种于96孔板并至于常氧或缺氧条件培养48 h后，每孔加入10 μL LDH释放试剂并于37 °C下孵育1 h，用OSE-MP25型微孔板离心机（天根生化科技（北京）有限公司）以500 r/min离心5 min收集细胞的上清液。并按照试剂盒说明，将上清液重新加到一个新的96孔板中，各孔分别加入50 μL LDH检测液，室温避光孵育30 min，用SuPerMax 3000FA型酶标仪（上海闪谱生物科技有限公司）检测450 nm处各孔光密度值以评估上清液中LDH的活性。

7 Hoechst染色

将已转染miR-NC或miR-21-5p-mimic的HPAE- C分别接种于96孔板并至于常氧或缺氧条件培养48 h后，将细胞用4%多聚甲醛固定，用5 μg/mL Hoechst 33342染料室温避光染色15 min，然后用TS-2型荧光显微镜（Nikon，日本）观察细胞核形态。

8 流式细胞术

将已转染miR-NC、miR-21-5p-mimic、miR-NC+ pcDNA-Con、miR-21-5p-mimic+pcDNA-Con、miR-21-5p-mimic+pcDNA-KLF6的HPAEC分别接种于6孔板并置于常氧或缺氧条件培养48 h后，并按照试剂盒说明书，在室温避光条件下分别孵育10 μL Annexin V-FITC和PI染液10 min，然后用EXFLOW-206型流式细胞仪（深圳市达科为生物技术股份有限公司）检测细胞凋亡率。

9 Western blot

用RIPA提取HPAEC的蛋白，Bradford法对蛋白定量后，用SDS-PAGE电泳分离蛋白，并将分离的蛋白转移至PVDF膜。将PVDF膜上蛋白用用5%（w/v）脱脂乳封闭后，室温孵育1:1000稀释的Cleaved caspase-3、KLF6和GAPDH或β-actin一抗2 h。用TBST洗膜后，室温孵育1:1000稀释的HRP偶联山羊抗兔或驴抗小鼠IgG (H+L)二抗1 h。TBST再次洗膜后，用化学发光液对条带显影，并用Image J软件通过光密度值测定法定量相对条带表达丰度，并用内参GAPDH或β-actin的条带的光密度值进行标准化。

10 miR-21-5p靶基因的预测和鉴定

用TargetScanHuman 7.2（http://www.targetscan.org/vert_72/）预测miR-21-5p靶基因。构建携带miR-21-5p靶基因KLF6的野生型（WT）或突变（MUT）3’-UTR的pmiRRB-report双荧光素酶报告载体质粒。用Lipofectamine 2000试剂分别将构建的WT或MUT的双荧光素酶报告载体质粒和miR-21-5p mimic或miR-NC转入细胞，并在转染48 h后，在GloMaxTM 20/20型生物化学发光分析仪（美国Promega公司）上用双荧光素酶报告基因测定试剂盒测量荧光素酶活性。

11 统计学分析

结果以均数±标准差表示。用SPSS 24.0软件对数据进行统计分析，多组数据间均数的两两比较采用单因素方差分析事后SNK-q检验。P＜0.05时，认为有统计差异。

结 果

1 缺氧导致HPAEC中miR-21-5p表达下调

首先探索miR-21-5p表达是否响应缺氧条件。RT-qPCR检测显示，与常氧条件相比，缺氧条件下HPAEC中miR-21-5p表达降低，并且随着缺氧时间的延长，miR-21-5p的表达水平逐渐降低。后续实验选择缺氧处理时间为48h。

图1 HPAEC在常氧条件48 h或暴露于缺氧条件12、24和48 h，RT-qPCR检测miR-21-5p的表达。与Normoxia组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与Hypoxia-12h组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与Hypoxia-24h组比较，&P＜0.05；n=3Fig. 1 The expression of miR-21-5p was detected by RT-qPCR after 48 h of normoxia condition or 12， 24 and 48 h of hypoxia exposure respectively. Compared with Normoxia group: *P＜0.05， **P＜0.01， ***P＜0.001; compared with Hypoxia-12h group: #P＜0.05， ##P＜0.01; compared with Hypoxia-24h group: &P＜0.05; n=3

2 过表达miR-21-5p减轻缺氧诱导的HPAEC损伤

LDH活性检测显示，与常氧条件下的miR-NC组相比，缺氧条件下miR-NC组HPAEC的LDH的释放活性明显增加；与缺氧条件下的miR-NC组比较，缺氧条件下的miR-21-5p-mimic组HPAEC的LDH的释放活性明显降低，但仍高于常氧条件下的miR-NC组（图2A）。Hoechst染色显示，常氧条件下的miR-NC组HPAEC的细胞核正常，缺氧条件下的miR-NC组HPAEC的细胞核出现核固缩和凋亡荧光碎片，但miR-21-5p-mimic转染可明显减轻缺氧诱导的这些现象（图2B）。流式细胞术检测显示，miR-21-5p-mimic转染可明显减少由缺氧诱导的HPAEC凋亡（图2C、D）。此外Western blot检测进一步证实，缺氧可导致HPAEC中Cleaved caspase-3升高，用miR-21-5p-mimic转染可显著抑制缺氧诱导的HPAEC中Cleaved caspase-3水平（图2E、F）。

图2 过表达miR-21-5p可减轻缺氧诱导的HPAEC损伤。A，LDH释放水平；Hoechst染色（比例尺，20 μm）；C，凋亡率代表性流式细胞术检测结果；D，凋亡率统计学分析；E，Cleaved caspase-3水平的代表性Western blot检测结果；F，Cleaved caspase-3水平统计学分析。与Normoxia+miR-NC组比较：*P＜0.05，***P＜0.001；与Hypoxia+miR-NC组比较：##P＜0.01；n=4。Fig. 2 Overexpression of miR-21-5p attenuated hypoxia-induced HPAEC injury. A， LDH release level of HPAEC in different treatment groups; B， Hoechst staining (scale bar， 20 μm); C， representative flow cytometry analysis of apoptosis rate; D， statistical analysis of the apoptosis rate; E， representative Western blot detection of Cleaved caspase-3 level; F， statistical analysis of Cleaved caspase-3 level. Compared with Normoxia + miR-NC group: *P＜0.05， ***P＜0.001; compared with Hypoxia + miR-NC group， ##P＜0.01; n=4

3 过表达KLF6抑制miR-21-5p对缺氧诱导的HPAEC损伤的保护作用

用TargetScanHuman 7.2软件预测KLF6可能是miR-21-5p的靶基因，因此，本研究首先检测了缺氧条件下HPAEC中KLF6水平。Western blot检测显示，与常氧条件比较，缺氧条件下HPAEC中KLF6蛋白表达明显升高（图3A、B）。对KLF6预测的与miR-21-5p具有结合位点的序列点突变（图3C）后，荧光素酶报告基因分析显示，miR-21-5p-mimic与KLF6 WT荧光报告质粒共转染能降低荧光相对活性，而miR-21-5p-mimic与KLF6 MUT荧光报告质粒共转染对荧光相对活性无影响（图3D）；且进一步通过Western blot证明miR-21-5p过表达能降低KLF4水平（图3E、F）。这些结果表明KLF6是miR-21-5p的靶基因。

为进一步验证KLF6在miR-21-5p抑制缺氧诱导的HPAEC损伤中的功能，本实验用pcDNA-KLF6和miR-21-5p-mimic共转染HPAEC，并评估细胞损伤的相关指标。结果显示，在缺氧条件下，与pcDNA-Con和miR-21-5p-mimic共转染比较，pcDNA-KLF6和miR-21-5p-mimic共转染显著增加HPAEC的LDH释放水平（图3G）和凋亡率（图3H、I）。这些结果表明，过表达KLF6能消除miR-21-5p对缺氧诱导的HPAEC损伤的抑制作用。

图3 miR-21-5p通过下调KLF6抗HPAEC缺氧损伤。A，缺氧对HPAEC中KLF6水平影响的代表性Western blot检测；B，缺氧对HPAEC中KLF6水平影响的统计学分析；与Normoxia组比较：***P＜0.001，n=3。C和D，miR-21-5p和KLF6之间的碱基互补序列（C）以及通过荧光素酶活性测定法验证（D）；与miR-NC组比较：###P＜0.001，n=3。E，miR-21-5p-mimic对HPAEC中KLF6水平影响的代表性Western blot检测；F，miR-21-5p-mimic对HPAEC中KLF6水平影响的统计学分析；与miR-NC组比较：###P＜0.001，n=3。G，缺氧、miR-21-5p-mimic和KLF6对HPAEC释放LDH影响的统计学分析；与Hypoxia+miR-NC+pcDNA-Con组比较：&&&P＜0.001，n=3。与Hypoxia+miR-21-5p-mimic+pcDNA-Con组比较：$$$P＜0.001，n=3。H，缺氧、miR-21-5p-mimic和KLF6对HPAEC凋亡的代表性流式细胞术检测结果I，缺氧、miR-21-5p-mimic和KLF6对HPAEC凋亡率的统计学分析；与Hypoxia+miR-NC+pcDNA-Con组比较：&&&P＜0.001；与Hypoxia+miR-21-5p-mimic+pcDNA-Con组比较：$$$P＜0.001；n=3Fig. 3 miR-21-5p inhibits hypoxia-induced injury of HPAEC by down-regulating KLF6. A， representative Western blot detection of the effect of hypoxia on KLF6 level in HPAEC; B， statistical analysis of the effect of hypoxia on KLF6 level in HPAEC; compared with normoxia group: ***P＜0.001， n=3. C and D， base complementation sequence between miR-21-5p and KLF6 (C) was verified by luciferase activity assay (D); compared with miR-NC group， ###P＜0.001， n=3. E， representative Western blot detection of the effect of miR-21-5p-mimic on KLF6 level in HPAEC; F， statistical analysis of the effect of miR-21-5p-mimic on KLF6 level in HPAEC; compared with miR-NC group， ###P＜0.001， n=3. G， statistical analysis of effect of hypoxia， miR-21-5p-mimic and KLF6 on LDH release from HPAEC; compared with Hypoxia + miR-NC + pcDNA-Con group， &&&P＜0.001， n=3. H， representative flow cytometry results of hypoxia， miR-21-5p-mimic and KLF6 on apoptosis of HPAEC; I， statistical analysis of effect of hypoxia， miR-21-5p-mimic and KLF6 on apoptosis rate of HPAEC; compared with Hypoxia + miR-NC + pcDNA-Con group， &&&P＜0.001; compared with Hypoxia+miR-21-5p-mimic+pcDNA-Con group， $$$P＜0.001; n=3

讨 论

PAH是一种慢性进行性和致命性疾病[1]。而目前，常用的治疗策略对PAH治疗效果有限[11]。众所周知，缺氧诱导的PAEC损伤参与低氧性PAH的病理过程[4，5]。以往的研究已经报道，在缺氧诱导的大鼠PAH模型中，肺动脉血管内膜完整性遭到严重破坏[8]。血管内膜主要由血管内皮构成，血管内皮不仅是血管与血液间的通透性屏障，而且血管内皮能分泌多种血管活性物质[12]。长期低氧能诱导血管内皮功能障碍，进而诱导PAEC活化、血管炎症增加、损伤凋亡、脱落和NO释放降低、血管收缩舒张功能障碍最终导致血管重构和血管闭塞，最终导致PAH的形成[13，14]。因此，抑制低氧诱导的PAEC损伤凋亡能促进肺动脉血管内皮的修复和改善内皮功能，进而改善PAH的血管重构。本研究结果显示，在缺氧诱导的HPAEC损伤的同时伴随着miR-21-5p表达的降低，而过表达miR-21-5p则能显著减轻缺氧诱导的HPAEC损伤，这一结果说明miR-21-5p可能是预防和治疗PAH的新靶点。

本研究进一步对miR-21-5p发挥细胞保护的机制进行了探索。miRNA是通过转录后抑制靶基因表达来发挥生物学效应[6]。本研究首先通过生物信息学发现KLF6与miR-21-5p存在碱基互补序列，并通过荧光素酶活性法和Western blot证实KLF6是miR-21-5p的靶基因。Krüppel样因子（KLF）可以与特定的DNA基序结合并调节代谢、细胞增殖和分化等各种细胞功能[15，16]。KLF6是该家族的一员，已经被报道其能促进细胞凋亡的作用[16，17]。本研究结果显示，miR-21-5p能通过下调KLF6来抑制缺氧诱导的HPAEC损伤。

总之，本研究结果显示，缺氧能下调HPAEC中的miR-21-5p表达，而过表达miR-21-5p则能抑制缺氧诱导的HPAEC损伤，且miR-21-5p这一功能通过下调靶基因KLF6编码的蛋白表达来实现。因此，miR-21-5p可能是预防和治疗PAH的新靶点。