基于分子对接和网络药理学探讨绞股蓝-半枝莲药对防治大肠癌的作用机制

赖冬萍，张 涛，廖美华，丁明健，杨 武

（1.广西中医药大学，广西 南宁530000；2.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁530011）

大肠癌（colorectal cancer，CRC）是世界第三大 最 常 见 的 恶 性 肿 瘤，位 居 第 四 的 致 命 癌 症［1，2］。目前现代医学治疗大肠癌的手段以手术为主，放化疗为辅。相关研究表明，绞股蓝和（或）半枝莲单味中药联合化疗在抑制大肠癌细胞活性及迁移 等 方 面 具 有 一 定 疗 效［3，4］。

绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino）属葫芦科植物，性甘、凉，归肺、脾、肾经，为名贵药材，《本草纲目》记载，具有清热解毒、益气健脾之效。现代药理机制研究发现，绞股蓝具有抗肿瘤、调节免疫、神经保护等作用［5］。半枝莲（Scutellaria barbata D. Don）系马唇形科黄芩属草本植物，最早见于《外科秘要》，性辛、平，入肺、肝、肾经，具有清热解毒，活血化瘀，消肿止痛之功。近期药理学研究提示，半枝莲具有抗癌、抗突变、解热、促进免疫功能恢复等药理作用［6，7］。

由于中医药成分的多样性和与人体相互作用的复杂性，阐明中医中药的分子机制是促使古代中医药实践与现代标准接轨的亟待解决的重要问题。目前对“绞股蓝-半枝莲”药对抗大肠癌的机制研究报道较少，从分子水平阐述抗大肠癌的作用机制缺乏系统化。分子对接是预测受体与配体相互作用和反应机制的模拟化手段，网络药理学是融合生物信息学、计算机技术、网络科学和系统药理学为一体的新兴学科［8］。疾病与化合物靶点网络全局化、系统化与中医的整体观念一脉相通。本研究基于分子对接和现代网络药理学方法，运用TCMSP、GeneCards、CTD、TTD 等数据库收集绞股蓝-半边莲药对治疗CRC 的相关靶点，构建“中药-活性成分-靶点”、蛋白互作（PPI）网络、靶基因功能通路等多层次生物信息网络，筛选出关键靶点和通路，进行活性成分与靶蛋白分子对接，探讨绞股蓝-半枝莲药对多成分、多靶点、多途径防治大肠癌的作用机制，以期为中医药潜在药物靶点防治大肠癌提供思路，为后续多靶点药物研发和基础及临床研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 绞股蓝-半枝莲活性化合物的筛选

本研究通过中药系统药理学和分析平台TC⁃MSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），经 过 查 阅文献［9］，以口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18，分别筛选出绞股蓝和半枝莲符合条件的化合物。

1.2 绞股蓝-半枝莲有效化合物靶点的收集

将以上TCMSP 中筛选出来的有效化合物借助DrugBank 数 据 库（https：//www.drugbank.ca/）获取每个化合物的有效作用靶点，得到绞股蓝-半枝莲化合物潜在靶点信息。将靶点信息导入STRING 数据库（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins，https：//string-db.org/）中Multiple Proteins 的检索，选择物种为“Homo sapiens”，剔除重复、非人源的靶点，规范靶点名称。

1.3 化合物-靶点网络的构建

将收集的中药化合物和有效靶点通过Cyto⁃scape 3.6.1 软 件（http：// www.cytoscape.org/）构建化合物-靶点网络。

1.4 大肠癌疾病靶标的获取

利 用GeneCards（https：//www. genecards. org/）、CTD 数据库（http：//ctdbase. org/）和TTD 数据库（http：//db.idrblab.net/ttd/）查找与大肠癌相关的靶点。数据库以关键词“colorectal cancer”进行检索，收集整合与大肠癌相关的靶标。

1.5 绞股蓝-半枝莲药对与大肠癌的共同靶点及蛋白互作网络（PPI）构建

通过Venn 2.1.0 在线分析工具获得绞股蓝-半枝莲药对和大肠癌共同交集的靶点，得出绞股蓝-半枝莲药对防治大肠癌的作用靶点基因。再将其共同 靶 点 上 传 至 在 线STRING11.0（https：//www.string-db.org/）获取基因靶点，设置物种为“Homo sapiens”，选取置信度高于0.7 的数据，构建蛋白互作网络图。 经Cytoscape 中进行节点大小和颜色的调整，构建共同作用靶点PPI 网络。

1.6 基因本体（gene ontology，GO）功能与KEGG通路富集分析

将上述筛选得到的绞股蓝-半枝莲药对与大肠癌共同靶标导入DAVID6.8 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），设置物种为“Homo Sapiens”，对交集靶点进行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。GO 功能分析包括生物过程（BP，biological pro⁃cess），细 胞 组 分（CC，cellular component），分子功能（MF，molecular function）。 将 分 析 结 果 运 用GraphPad 软件和R 语言分析软件进行可视化处理。

1.7 核心活性成分-靶点分子对接验证

以“活性成分-靶标-疾病”网络中节点“Degree”参数大于均值为条件筛选核心化合物，并从TC⁃MSP 数据库中下载核心化合物的mol2 文件，导入AutoDock Tools 1.5.6 软件，保存为pdbqt 格式。从PDB 数据库（https：//www.rcsb.org）下载关键靶蛋白的3D 结构，通过PyMOL 软件对蛋白质进行移除水分子和多余的非活性配体，导入AutoDock Tools 1.5.6 软件加氢、加电荷处理，输出为pdbqt 格式。根据参数文件，用命令提示符（CMD）运行分子对接过程，选择“Local Search Parameters”计算方法，对对接结果（Blind energy）进行打分，得出全局最优结合构象，利用Discovery Studio Visualizer 和PyMOL将对接结果可视化。

2 结果

2.1 活性化合物的筛选

根据TCMSP 平台中OB ≥30% 和DL≥0.18的界定值和去重处理后，本研究共纳入49 个活性化合物，其中绞股蓝24 个，半枝莲25 个（已去掉4 个重复化合物）。这49 个化合物包括人参皂甙f2（Gin⁃senoside f2）、槲皮素（Quercetin）、黄芩苷（Baicalin）、豆甾醇（Stigmasterol）、雌黄醇（Eriodictyol）、木犀草素（Luteolin）、复 方 黄 酮（Moslosooflavone）等。见表1。

表1 绞股蓝-半枝莲活性化合物基本信息Tab 1 Basic information of the active compounds of Gynostemma pentaphyllum-Scutellaria barbata

续表

2.2 绞股蓝−半枝莲药对有效化合物靶点预测

通过DrugBank 数据库对绞股蓝-半枝莲药对中筛选出的49 个化合物进行靶点预测，再将这些靶蛋白导入STRING 数据库中，剔除非人源蛋白和重复蛋白，最后整合共得到15 个化合物，116 个靶点。将得到的结果导入Cytoscape 软件中构建“化合物-靶点”网络图。内环红色节点表示分子化合物MOL 编号，外环蓝色节点表示潜在靶点。见图1。

图1 绞股蓝-半枝莲药对化合物-靶点网络图Fig 1 Gynostemma pentaphyllum-Scutellaria barbata pair compound-target network diagram

2.3 绞股蓝-半枝莲药对有效成分与大肠癌靶点的Venny 分析

从CTD、Genecards、TTD 三个数据库筛 选出750 个大肠癌相关靶点，与绞股蓝-半枝莲药对的116 个作用靶点取交集，获得49 个交集靶点，分别为TP53、JUN、MAPK1、HSP90AA1、EGF、IL6、EG⁃FR、TNF、VEGFA、PTGS2、IL1B、ESR1、MAPK14等。见图2。

图2 绞股蓝-半枝莲药对活性成分与CRC 靶点Venny 分析图Fig 2 Gynostemma pentaphyllum-Scutellaria barbata active ingredient and CRC target Venny analysis chart

2.4 绞股蓝-半边莲药对与大肠癌的交集靶点蛋白互作网络

将 49 个共同靶点上传至 STRING11.0（https：//www.string-db.org/）规范基因靶点名称，设置物种为“Homo sapiens”，选取置信度高于0.7 的数据，构建蛋白互作网络图，利用Cytoscape 可视化处理，核心网络图包含47 个节点（剔除2 个游离靶蛋白），228 条边，其中节点表示蛋白，每条边则表示蛋白与蛋白之间的相互作用关系，线条越多表示关联度越大，见图3。平均度值是9.7，超过平均度值的靶点有19 个，推测这19 个靶点为绞股蓝-半枝莲作用于大肠癌的关键靶点。根据网络拓扑学性质将靶点按照度值由高到低排序。见表2。

2.5 绞股蓝-半枝莲药对与CRC 靶点全局性网络分析

将绞股蓝-半枝莲药对化合物-靶点网络和绞股蓝-半枝莲与CRC 交集作用靶点PPI 网络通过Cytoscape 软件合成全局性蛋白互作网络。见图4。

2.6 绞股蓝-半枝莲对大肠癌的作用靶点GO 功能富集注释分析

图3 绞股蓝-半枝莲对CRC 作用靶点的蛋白互作网络Fig 3 Protein interaction network of Gynostemma pentaphyllum-Scutellaria barbata against CRC

表2 PPI 网络中大于平均度值的靶标蛋白Tab 2 Target proteins in the PPI network that are greater than the average value

图4 绞股蓝-半枝莲药对与CRC 靶点全局性共网络Fig 4 Gynostemma pentaphyllum-Scutellaria barbata pair and CRC target global network

借助DAVID 6.8 数据库的GO 富集分析功能，得出36 个生物学过程（biological process，BP）（P＜0.01），包括：Ras 蛋白信号转导、肽基丝氨酸磷酸化、一氧化氮生物合成过程的正调控、RNA 聚合酶II 启动子转录的正调控、肽基苏氨酸磷酸化、转录的正调控、宿主共生体生长的负调控、调节细胞增殖、调节炎症反应中涉及的细胞因子产生、环氧合酶途径等方面。11 个细胞组分（cellular component，CC）（P＜0.05），包括：细胞外空间、胞质溶胶、转录因子复合体、染色质、线粒体、高尔基体、核膜、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物、复制叉、核染色质等等。16 个分子功能（mo- lecular function，MF）（P＜0.01），包括：血红素结合、类固醇结合、核心启动子序列特异性DNA 结合、细胞周期蛋白依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、转录调控区DNA 结合、序列特异性DNA 结合、ATP 结合、生长因子活性、过氧化物酶活性、前列腺素-内过氧化物合酶活性、组蛋白激酶活性、转录因子活性，序列特异性DNA 结合等方面。具体GO 分析注释见图5。

2.7 绞股蓝-半枝莲对大肠癌的作用靶点KEGG通路富集分析

通过DAVID6.8 数据库进行KEGG 通路富集分析功能，分析结果显示绞股蓝-半枝莲药对作用于大肠癌的通路有67 条（P＜0.01），包括癌症信号通路、膀胱癌、HIF-1 信号通路、胰腺癌、PI3K-Akt 信号通路、炎症性肠病、结直肠癌、癌症中的MicroRNA、p53 信号通路、NF-κ B 信号通路、细胞凋亡等信号通路。将KEGG 通路富集分析的前30 条通路导入R 语言分析软件进行可视化处理，见图6。相关性较大的癌症信号通路图，见图7。

图5 绞股蓝−半枝莲对CRC 作用靶点的GO 功能富集BP、CC、MF 分析柱状图Fig 5 The histogram of BP，CC，MF analysis of GO function enrichment of Gynostemma pentaphyllum-Scutellaria barbata on the target of CRC

2.8 核心成分作用于关键靶点的分子对接结果

在“ 活性成分-靶标-疾病”网络分析中，根据拓扑学参数计算得出排名前五的核心化 合 物 为 ：MOL000098 （ 槲 皮 素 ） 、MOL000351（3，7-二 甲 氧 基-3'，4'，5-三 羟 基黄 酮）、MOL000358（β-谷 甾 醇）、MOL005440（异 木 甾 醇）、MOL000006（木 犀 草 素）。 分子对接方法通过匹配原则算法模拟蛋白质与小分子受体互作。 研究表明，配体与受体结合能量越低，结合构象越稳定，相互作用的可能性越大［10］。 本研究结果显示绞股蓝-半枝莲的核心化合物与大肠癌共同靶点结合能（Blind energy）均为负值，提示化合物与受体有一定的结合活性，结合能小于−5 kJ/mol 证 明 有 较 强 的 结 合 活 性［11］。 分 子 对接结果见图8，有强烈的结合活性化合物与受体分子对接模式见图9。 表明绞股蓝-半枝莲药对的活性成分与大肠癌交集的靶标蛋白具有较好的结合活性。

图6 绞股蓝-半枝莲药对与大肠癌作用靶点的KEGG 分析的气泡图（Top30）Fig 6 Bubble diagram of KEGG analysis of the target of Gynostemma pentaphyllum-Scutellaria barbata against colon cancer（Top30）

图7 绞股蓝-半枝莲对CRC 作用的Pathways in cancer 信号通路靶基因的KEGG 通路分析Fig 7 KEGG pathway analysis of the target genes of pathways in cancer signaling pathway of Gynostemma pentaphyllum-Scutellaria barbata on CRC

图8 绞股蓝-半枝莲对CRC 作用靶点分子对接的结合能Fig 8 Binding energy of Gynostemma pentaphyllum-Scutellaria barbata to CRC target molecular docking（- kJ/mol）

图9 核心活性成分与潜在治疗靶点分子对接模式Fig 9 Molecular docking mode of core active ingredients and potential therapeutic targets

3 讨论

大肠癌在中医归属“肠瘤”、“肠蕈”等范畴，《灵枢·刺节真邪》云：“虚邪之入于身也深，寒与热相搏，久留而内著，……津液久留，合而为肠瘤，久者数岁乃成，以手按之柔。”其中医基本病机是本虚标实，寒热互结，津液久滞于体内，故为“肠瘤”。本课题组前期研究发现大肠癌以“脾胃虚弱为本、湿热瘀毒为标”而贯穿疾病始终［12］，当以健脾清热活血为治疗大法。肺与大肠相表里，大肠主津，以通为用，肺通调水道，布散津液，二者互为表里，相辅相成。若肺失肃降，水液输布失常，大肠传导失司，湿、瘀、毒易留于肠腑，而为肠癌［13］。绞股蓝-半枝莲药对具有清热解毒、活血化瘀、益气健脾之效，化瘀散结，调经通络，皆为抗癌要药［14］。“异病同治”是中医整体观的内涵，“绞股蓝-半枝莲”药对防治大肠癌蕴含了以肺之药治疗大肠病变的“肺肠合治”思想。本研究通过分子对接及现代网络药理学方法初步探讨“绞股蓝-半枝莲”抗大肠癌的分子机制，从多靶点、多信号通路的角度揭示其抗大肠癌的作用机理。

本研究结果显示，“绞股蓝-半枝莲”药对有效活性化合物共15 个，对应靶点116 个，与大肠癌相关的共同靶点49 个。关键的活性成分为β-谷甾醇、人参皂甙f2、槲皮素、异木甾醇、黄芩苷、木犀草素、复方黄酮等等，同时也是对接较好的活性化合物。人参皂甙已被证实可诱导大肠癌细胞周期阻滞和凋亡［15］。槲皮素对HCT-116 细胞具有强细胞毒性和抗氧化应激作用［16］。黄芩苷通过下调SP1 转录因子诱导SW480 细胞凋亡［17］。研究发现木犀草素和天然黄酮类化合物具有很强的促肿瘤凋亡、抑制肿瘤增殖和阻断肿瘤血管生成的能力，具有良好的先导 抗 肿 瘤 效 用［18，19］。构 建 绞 股 蓝-半 枝 莲 药 对 与CRC 的蛋白互作（PPI）网络后发现其潜在的核心靶蛋 白 为TP53、JUN、MAPK1、HSP90AA1、EGF、IL6、EGFR、TNF、VEGFA 等。TP53 属肿瘤抑制蛋白，可诱导细胞周期停滞、凋亡，其突变普遍存在各种癌症。相关Meta 分析表明，TP53 可能作为炎症性肠病相关大肠癌和发育异常筛查的生物标志物和治疗靶点［20］。TP53 突变可导致炎症和先天免疫途径的显著激活，诱导大肠癌的进展［21］，与大肠癌预后和免疫应答密切相关［22］。JUN 原癌基因参与恶性肿瘤易位和缺失。MAPK1 作为多种生化信号的整合点，参与增殖、分化、转录调节和发育等多种生物学过程。 miR-422a 通过靶向AKT1 和MAPK1 抑制结直肠癌细胞增殖［23］。消化道肿瘤生物标记物网络分析结果表明，TP53、EGFR 和HSP90AA1 可作为大肠癌的预测性生物标记物［24］。Toyoshima 等［25］研究发现，IL6 是肿瘤携带状态下产生的促炎细胞因子，IL6 低表达可提高宿主的免疫，从而抑制大肠癌转移［26］。越来越多的证据表明，抑制TNF-α 诱导的EMT 和大肠癌细胞迁移和侵袭，成为潜在靶点［27］。Dilshar 等［28］通过体外实验证实P53 介导的氧化应激通过上调DR5 和诱导TNF 凋亡增强了I3M 诱导的结肠癌细胞凋亡。在一项前瞻性回顾性研究中，发现不同的VEGFA 亚型的生物学作用和预后意义在右侧和左侧原发性结肠癌中存在差异［29］。下调NEAT1 和VEGFA 可抑制大肠癌细胞增殖、迁移和侵袭［30］。综上可见，绞股蓝-半枝莲药对的有效成分靶点与大肠癌的疾病靶点相互作用，充分发挥中药多成分、多靶点的独特优势，防治大肠癌的效用。

在绞股蓝-半枝莲对CRC 的GO 分析结果得出36 个生物学过程（P＜0.01），主要包括Ras 蛋白信号转导、宿主共生体生长的负调控、调节细胞增殖、调节炎症因子等方面。炎症是大肠癌发生的驱动因素，推测绞股蓝-半枝莲通过下调炎性因子表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖，这可能是开发有效的癌症抗炎免疫疗法的希望目标。绞股蓝-半枝莲可能通过调节大肠癌肿瘤微环境，协调宿主与共生体的平衡，从而实现机体内环境稳态。在绞股蓝-半枝莲对CRC 的KEGG 通路富集分析结果得出67 条信号通路（P＜0.01），其中富集靶点最多的是癌症通路，涉及促炎癌变机制、miRNA 调控机制、细胞凋亡等等。现有研究表明，多种MicroRNA 可作为大肠癌患者预后的生物标志物［31］。中医药可能通过直接或间接靶向调节相应miRNA 表达，继而恢复miRNA 与癌基因或抑癌基因之间的平衡状态，维持机体的阴阳平衡，达到防治癌病的作用，实现治病求本。绞股蓝-半枝莲药对活性成分通过多信号、多途径而实现对大肠癌的调控。

本研究基于分子对接和网络药理学层面对绞股蓝-半枝莲药对抗大肠癌的活性成分、潜在靶点和作用机制进行了初步预测。从15 种化合物中筛选得到116 个活性潜在靶点与大肠癌的49 个靶点显著相关。这些关键靶点可能通过抗炎、抗氧化应激、正向调控细胞凋亡、维持机体稳态等方面实现药效作用。本研究还挖掘了30 条绞股蓝-半枝莲药对防治大肠癌的潜在信号通路，为进一步的实验研究、多靶点药物研发提供基础和方向。鉴于网络药理学方法具有一定的局限性，后期仍需开展生物学实验验证相关通路及大量循证医学证据支持。