脊髓损伤分子机制的生物信息学分析

2021-04-08 07:57刘冬

东南大学学报（医学版） 2021年1期

刘冬

(东南大学附属中大医院，江苏南京 210009)

脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)病因可为非创伤性，也可为创伤性。创伤性SCI为SCI的严重并发症之一, 多由高处坠落、交通事故、体育运动意外等导致，患者损伤平面以下肢体发生严重功能障碍，对其身心造成极大的痛苦[1- 2]。手术解除压迫、物理治疗、急性期大量激素治疗均是临床使用较多的治疗SCI的方法，目前研究较多的还有神经再生及神经保护疗法，但均未取得较大突破[3- 4]。因此，阐明SCI的分子机制很有必要。

SCI包括两种损伤机制，即原发性和继发性损伤。原发性损伤(机械损伤、出血等)为不可逆损伤，多出现于损伤后4 h内。原发损伤引发复杂的继发性损伤级联反应，导致细胞进行性死亡、局部缺血及炎症[5- 6]。由于继发性损伤的可干预性，如何通过发生机制进行研究和给予有效的治疗策略成为近些年来关注的热点。随着生物医学的发展，高通量基因芯片技术等开始普及于疾病发生发展过程中分子变化的探索，这为SCI发病机制的研究提供了新方向。在最近的许多生物信息学研究中，分析了SCI后的不同时间点转录组[7- 8]，并对各种分子事件进行了表征，进一步说明了免疫应答、炎症相关功能、脉管系统发育和神经系统功能在SCI的发展中发挥了作用[9- 11]。

在本研究中，利用GSE45006转录组数据集，分别评估损伤后3个时间点，即1 d、3 d和1周的差异表达基因(DEG)以进行通路和功能富集分析，构建蛋白质- 蛋白质相互作用(PPI)网络，并通过软件分析关键基因，以揭示可能与SCI相关的分子机制，同时为SCI的治疗提供潜在靶标。

1 材料和方法

1.1 微阵列数据分析

NCBI- GEO为微阵列和基因表达谱的免费公共数据库，从中获得数据集GSE45006 SCI组和假手术组脊髓组织中的全基因组基因表达概况。测序平台为GPL1355 ([Rat230_2] Affymetrix Rat Genome 230 2.0 Array)，使用动脉瘤夹冲击压缩损伤模型损伤大鼠胸脊髓(T7)，并分离受伤脊髓的震中区域组织，在基因芯片阵列上行后续检测，其中包括4个假手术组和20个SCI组。

1.2 DEG数据处理

使用在线分析工具GEO2R 筛选DEG[12]。在本研究中，数据分为以下成对的组：在1、3 d和1、2、8周的假手术组和SCI组，通过P<0.05和|logFC|>2作为临界点选择DEG，然后在Draw Venn Diagram(http:∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)输入TXT格式的原始数据，在线比较DEG并构建Venn图。

1.3 功能富集分析

利用DAVID(http：∥david.abcc.ncifcrf.gov/summary.jsp)在线数据进行KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 途径分析[13], 同时利用WebGestalt(WEB- based GEne SeT AnaLysis Toolkit，http:∥www.webgestalt.org)在线数据库进行GO (gene ontology)分析，从生物过程(biological process, BP)、细胞组分(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF) 3个方面注释差异基因的功能, WebGestalt是目前进行DEG功能注释的权威数据库[14]。

1.4 PPI网络和模块分析

通过在线工具STRING(检索相互作用基因的搜索工具)来评估PPI信息[15]。然后，使用Cytoscape[16]中的STRING应用程序检查这些DEG之间的潜在相关性。此外，通过Cytoscape中的MCODE应用程序用于检查PPI网络的模块预测关键基因。

2 结果

2.1 确定差异表达基因

通过GEO2R在线工具，数据归一化，评估交叉可比性(图1)，分析5个时间点的DEGs。与假手术组比较，在1、3 d和1、2、8周，SCI组分别有1 189、591、741、568、571个DEGs上调；966、294、537、438、432个DEGs下调(图2)。DEGs数量变化波动结果表明基因表达改变发生在损伤后1、3 d和1周。用韦恩图网站分别识别1 d、3 d和1周的DEGs，共监测到369种DEGs，包括SCI震中组织中的248个上调基因(logFC>0)和121个下调基因(logFC<0)(图3和表1)。

2.2 功能富集分析

通过WebGestalt数据库对全部369种DEGs进行分析，GO分析结果表明：(1) BP主要涉及生物调节、对刺激的反应、代谢过程、定位、发育过程等；(2) CC主要涉及细胞膜、细胞核、含蛋白质复合物、内膜系统、胞浆细胞等；(3) MF主要涉及蛋白质结合、离子结合、核苷酸结合、水解酶活性、核算结合等(图4)。通过DAVID数据库对全部369种DEGs进行分析，KEGG分析结果如表2所示。总体而言，本研究中DEGs主要与免疫和炎症功能相关。

图1 假手术组和SCI组基因表达的箱型图数据标准化和交叉可比性

图2 假手术组和SCI组在5个时间点之间的DEG数量

左：3个数据集中上调了248个DEGs(logFC>0)；右：3个数据集中下调了121个DEGs(logFC<0)

2.3 PPI和模块分析

通过STRING在线数据库输入369个DEGs，分析构建PPI网络，将得到的数据利用Cytoscape软件进行更全面的生物信息学分析。利用MCODE插件进行模块分析，得到20个中心节点(图5)。

2.4 20个选定基因重新KEGG富集分析

为了了解这20 个DEGs可能涉及的通路途径，再次使用DAVID数据库对其进行了KEGG分析。结果显示，5个基因(CCNA2、Cdk1、Mcm2、Mcm4、Mcm6)显著富集于细胞周期途径中(图6)。

3 讨论

动物SCI的实验模型已被广泛用于研究复杂的脊髓继发性级联损伤[17]。GSE45006数据集包括了SCI后1、3 d和1、2、8周5个时间点受伤脊髓的震中区域组织中以及假手术组脊髓组织中获得的转录组数据。本研究采用生物信息学分析确定SCI中的分子事件和病理状态。基于不同时间点的基因表达分析，确定3个时间点的共同DEGs，并进行KEGG和GO的富集分析。此外，构建PPI网络和行模块分析进一步了解SCI的分子过程，最后再把选中的基因进行KEGG分析。本研究中进行的分析可能有助于更好地理解SCI。

本研究KEGG和GO富集分析表明，1、3 d和1周3个时间点的共同DEGs主要与免疫反应及炎症反应有关。炎症是继发性SCI过程的标志[18]。如前所述，SCI的严重程度与急性炎症反应(其中包括促炎症细胞因子和免疫细胞)强度之间存在关联。促炎症因子(IL- 1b、IL- 6和IL- 7)和抗炎症细胞因子(IL- 4和IL- 10)的表达显著增加，反映了受损组织的变性与存活之间的调控[18- 19]。一种保护性策略是针对炎症过程并限制免疫细胞向损伤部位的浸润[20- 21]。值得注意的是，另一组与炎症相关的基因，包括Cd44、Cybb、Icam1、Cyba、Hck、Casp1、Tgfb1、Rac2、Itgb2和Cxcr4与促炎症因子(IL- 1β、IL- 6和IL- 7)相比表现出不同的时间模式，表明受损部位存在复杂的炎症性免疫微环境，需要进一步分析。这些发现确认了SCI后随时间推移重复进行炎症检测的重要性[18]。

表1 脊髓损伤组3个时间点检测到的所有369个DEGs(248个上调基因和121个下调基因)

细胞周期蛋白A2(CCNA2)是一种在G1期积累的细胞周期蛋白，在G1/S和G2/M的过渡时期起调节作用[22]。有研究[23]表明，在SCI早期急性期的生物信息学分析中，PPI网络中显示CCNA2是排名前10位的核心基因。SCI引起与认知及情感变化相关的脑部炎症，这可能与M1型小胶质细胞的延迟持续诱导及相关的细胞周期活化有关，从而导致认知缺陷和生理性抑郁[24]。

SCI可以诱导细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)活性增加，包括CDK1，并增加细胞周期蛋白B1(CCNB1，是CDK1的主要激活因子)的水平，此外在体外实验或者大鼠SCI模型中抑制E2F1/CDK1信号通路具有神经保护功能[25]。

微染色体维持复合物(MCM)在确定细胞复制潜力中起着至关重要的作用，而且在细胞对DNA损伤的反应中也起着至关重要的作用。事实上，MCM蛋白不仅与S期检查点调节器相互作用，还与DNA修复途径有关[26- 27]。MCM2基因在大鼠SCI中起到关键作用[28]。

有不少研究证明CCNA2、cdKI、Mcm2、Mcm4、Mcm6这5个基因可能与SCI的预后有关，但从PubMed网站上搜索这5个基因来看，关于SCI的报道很少，因此本研究数据可以为SCI的进一步研究提供有用的信息和方向。

本研究的局限性在于原始数据不包括损伤后6个月的慢性期，也不包括非常急性期(SCI后0.5、4 h)的基因表达数据以及KEGG和GO富集分析数据，这限制了SCI发展过程中有关分子过程的信息。同时，SCI组所取组织仅仅为损伤震中区域的组织，如果通过获得其他位置组织的转录数据进行全面分析，可能会进一步揭示病理生理过程中发生的复杂变化。