ROCK抑制剂Y-27632在体外培养的兔角膜内皮细胞紫外线损伤修复中的作用△

朱娉 姜志昕 郝朋 赵堪兴 李轩

角膜内皮细胞是角膜组织最内层的细胞，可通过离子泵功能调节基质含水量，对维持角膜透明性至关重要。角膜内皮细胞在体内的增殖能力非常低，通常靠邻近细胞的扩大及迁移来填补衰老和损伤丧失的细胞。生理情况下，角膜内皮细胞以每年0.3%～0.6%的速度下降[1]。当角膜内皮细胞密度降低到一定程度的，会导致角膜内皮功能失代偿，引起大泡性角膜病变。目前，大泡性角膜病变的主要治疗方法是角膜移植。角膜移植虽应用广泛，但移植带来的排斥反应与细胞密度下降等问题还没有得到解决[2]。药物治疗对干细胞或祖细胞仍存在的早期角膜内皮细胞病变是一种更有前景的治疗方式。

Rho是一种分子开关，可响应来自G蛋白偶联受体和细胞表面受体结合细胞因子、生长因子和黏附分子的信息。Rho/ROCK信号通路广泛参与细胞的各种基本活动，如细胞黏附、运动、增殖、分化和凋亡[3]。ROCK抑制剂可刺激体内的角膜内皮细胞增殖和黏附[4]。在一项具有里程碑意义的临床研究中，体外培养的角膜内皮细胞与ROCK抑制剂Y-27632联合使用可提高大泡性角膜病变患者的角膜内皮细胞密度并改善其视敏度[5]。本研究拟探讨ROCK抑制剂Y-27632对体外培养的兔角膜内皮细胞(rabbit corneal endothelial cells，RCECs)紫外线损伤修复的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物健康清洁级成年新西兰大白兔30只(天津医科大学实验动物中心)，雌雄兼用，体质量2.0～2.5 kg，所有动物的眼部屈光间质透明，无眼前节病变。实验动物的使用和喂养遵循国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》。

1.1.2 主要试剂及仪器Opti-MEM培养液、Y-27632二盐酸化物、BrdU细胞增殖ELISA试剂盒、抗细胞周期蛋白依赖激酶(Cdk2)抗体、抗CyclinD1抗体(英国Abcam公司);胰蛋白酶(美国Biotopped公司);四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司);BCA蛋白定量试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)；CO2培养箱 (德国Heraeus公司);倒置相差显微镜(日本Nikon公司)；Realplex2荧光定量PCR仪(德国Eppendorp公司); 酶联免疫检测仪、恒温摇床(美国Thermo公司)；X射线摄影暗匣(广东粤华医疗器械厂)；X射线胶片(北京沃比森科技有限公司)；PVDF膜(天津华生源科技有限公司)；紫外线灯(北京中仪博腾有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 RCECs的分离培养空气栓塞法处死实验动物后立即摘取眼球，显微镜下剪下角膜片，完整撕除角膜后弹力层和内皮层，用胰蛋白酶消化法获取原代RCECs，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化和传代。

1.2.2 分组取第2代RCECs分为三组：A组为正常对照组，RCECs常规培养液培养；B组为紫外线照射组，去除培养液的RCECs经紫外线(功率≥30 W,照射强度≥30 μW·cm-2)照射20 s(照射时间根据预实验确定)，制备RCECs紫外线损伤模型，加入常规内皮细胞培养液培养；C组为紫外线照射+Y-27632组，RCECs经紫外线照射20 s后加入终浓度为10 μmol·L-1Y-27632的培养液培养。

1.2.3 MTT比色法检测各组RCECs活性A、B、C三组的RCECs按照每孔5×103个接种于96孔板中，每组设5个复孔，每孔中加入5 g·L-1MTT溶液20 μL，培养箱中孵育4 h，加入150 μL DMSO溶液，置于室温摇床振荡10 min，空白对照组为150 μL DMSO，酶联免疫检测仪测490 nm处的光密度值。

1.2.4 Transwell实验检测细胞迁移能力A、B、C三组的RCECs按照每孔5×105个加到孔径为8 μm的Transwell小室的上室，每孔100 μL培养液，下室分别加入A、B、C组对应培养液各600 μL，每组设3个复孔。将小室置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中孵育12 h，擦去上室滤膜上层细胞，将滤膜底面细胞固定，染色3 min，置于倒置显微镜下观察，随机取3个视野(×100)计数迁移到底面的细胞，取其均值记录。

1.2.5 BrdU细胞增殖实验A、B、C三组的RCECs按照每孔2×105个接种于96孔板中，同时设置空白对照组和背景组，每组设5个复孔，除背景组外每孔加20 μL BrdU置于培养箱中孵育24 h。加入200 μL ELISA试剂盒里的固定液，室温培育30 min，缓冲液洗涤3次，晾干。添加100 μL抗BrdU的单克隆探测抗体，室温下孵育1 h，洗涤3次，晾干。加入100 μL滤过的羊抗鼠IgG抗体，室温下孵育30 min，洗涤2次，晾干。添加100 μL TMB过氧化物酶底物，黑暗环境室温下培育30 min。加入100 μL终止液终止反应。以空白孔调零，酶联免疫检测仪测量450 nm波长下各孔的光密度值。

1.2.6 细胞黏附实验A、B、C三组的RCECs按照每孔104个接种于96孔板中，每组设置5个复孔。吸除孔中培养液(悬浮未黏附的细胞)，各组中重新加入培养液100 μL、5 g·L-1MTT溶液20 μL，培养箱中孵育4 h。吸除培养液，加入150 μL DMSO溶液，置于室温摇床振荡10 min，空白对照组为150 μL DMSO，酶联免疫检测仪测定490 nm处的光密度值。

1.2.7 实时荧光定量PCR检测细胞周期蛋白CyclinD1和细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子(CDKN1B) mRNA的相对表达量均以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH；PCR扩增细胞的标志性基因)作为内参对照的校准基因。引物由大连宝生物有限公司设计并合成。 Cyclin D1上游引物为5’-TTGTCTCAAAGCCTGCCAGG-3’，下游引物为5’- TTGGTCCAGTTCATCCTCCG-3’；CDKN1B的上游引物为5’-CGCCTGCAGAAACCTCTTCG-3’，下游引物为5’- ATTCCACTTGCGCTGGCTCG-3’。扩增条件(按下述条件进行PCR反应):95 ℃预变性15 s，95 ℃变性15 s、57 ℃退火30 s、74 ℃延伸30 s，进行45个循环；熔解曲线分析:95 ℃反应15 s，60 ℃反应30 s，95 ℃反应15 s，最后4 ℃直至结束。以GAPDH基因作为内参，应用2-△△Ct计算各基因的相对表达量。

1.2.8 Western blot检测各组CyclinD1和Cdk2蛋白相对表达量BCA法对三组RCECs细胞总蛋白进行蛋白定量；进行SDS-PAGE电泳，转膜；TBST溶液中封闭1 h。加入抗GAPDH抗体、抗CyclinD1抗体、抗Cdk2抗体，4 ℃摇床中孵育过夜；加入按适当比例稀释后的二抗，室温下孵育2 h。将 ECL显影液涂布于膜上条带相应位置，于LAS4000Mini 型化学发光成像分析仪中曝光; 用IPP6.0图像分析软件分析目标条带的光密度值，经内参平衡后作为蛋白的定量分析。

2 结果

2.1 各组RCECs活性的比较MTT比色法检测结果显示，设定A组细胞活性为100%，B组、C组细胞活性分别为(80.61±3.04)%和(92.55±4.56)%,三组间细胞活性的总体比较差异有统计学意义(F=12.381，P=0.004)。两两比较结果显示，B组细胞活性显著低于A组和C组，差异均有统计学意义(P=0.000、0.025)。

2.2 各组RCECs迁移能力的比较Transwell实验检测结果显示，显微镜下计数Transwell滤膜底面的迁移细胞数目(图1)，B组迁移细胞数目[(39.3±4.4)个/高倍视野]较A组[ (77.0±6.7)个/高倍视野)]和C组[(54.3±3.4)个/高倍视野]减少，差异均有统计学意义(P=0.023、0.015)。

图1 Transwell迁移实验检测各组迁移细胞数(×100) 箭头所示为滤膜底面的细胞。

2.3 各组RCECs增殖能力的比较BrdU可以掺入细胞复制新合成的DNA中，BrdU特异性抗体检测BrdU，检测到的BrdU特异性抗体越多，光密度值越高。A、B、C组的光密度值分别为0.35±0.08、0.24±0.05、0.30±0.07。对三组细胞光密度值进行单因素方差分析结果显示，三组间细胞光密度值总体差异有统计学意义(F=5.370，P=0.015)。组间两两比较结果显示，与A组相比，B组细胞增殖能力下降，差异有统计学意义(P=0.001)；C组与B组比较，细胞增殖能力增高，差异有统计学意义(P=0.015)。

2.4 各组RCECs黏附能力的比较细胞黏附实验结果显示，A、 B、C 组的光密度值分别为0.541±0.010、0.183±0.010、0.353±0.030。对三组细胞光密度值进行单因素方差分析结果显示，三组间细胞光密度值总体差异有统计学意义(F=7.470，P=0.000)。组间两两比较结果显示，与A组相比，B组细胞黏附能力明显下降，差异有统计学意义(P=0.001)；C组与B组比较，细胞黏附能力增高，差异有统计学意义(P=0.000)。

2.5 实时荧光定量PCR检测各组CyclinD1和CDKN1B mRNA的相对表达量实时荧光定量PCR检测结果显示，各组CyclinD1和CDKN1B mRNA的相对表达量总体比较差异均有统计学意义(F=27.561、16.789，均为P<0.01)。与A组相比，B组的CyclinD1 mRNA相对表达量降低，CDKN1B mRNA相对表达量增加，差异均有统计学意义(P=0.003、0.002)。与B组相比，C组的CyclinD1 mRNA相对表达量增加，CDKN1B mRNA相对表达量减少，差异均有统计学意义(P=0.013、0.022)(见表1)。

表1 各组CyclinD1 及CDKN1B mRNA相对表达量

2.6 Western blot检测各组CyclinD1和Cdk2蛋白表达各组CyclinD1、Cdk2蛋白表达结果见图2。三组细胞中CyclinD1/GAPDH蛋白表达量分别为0.43±0.12、0.21±0.09、0.34±0.11，Cdk2/GAPDH蛋白表达量分别为0.62±0.19、0.38±0.10、0.51±0.14，总体比较差异均有统计学意义(F=9.327、6.936，均为P<0.05)。与A组相比，B组CyclinD1、Cdk2蛋白表达量均降低，差异均有统计学意义(P=0.014、0.005)。与B组相比，C组CyclinD1、Cdk2蛋白表达量均增加，差异均有统计学意义(P=0.027、0.002)。

图2 Western blot检测各组CyclinD1、Cdk2蛋白表达情况

3 讨论

角膜上皮伤口愈合通常包括细胞迁移、扩散和增殖。然而，角膜内皮细胞在最初形成单层后通常不增殖，细胞增大和迁移是角膜内皮修复的主要过程。因此，内皮细胞过度丧失而无法增殖以恢复细胞密度可能导致其泵功能失代偿，形成不可逆的角膜水肿[6]。尽管角膜移植是治疗角膜内皮功能障碍的主要方法，但存在一些挑战，包括供体组织不足，术前和术后并发症，例如感染、同种异体移植排斥以及相关的供体内皮细胞破坏。因此，通过组织工程技术移植体外培养的人角膜内皮细胞或者药物治疗可作为角膜内皮功能障碍的替代疗法。

大量研究表明，ROCK抑制剂可增加角膜内皮细胞的增殖和迁移，同时降低其凋亡[7-9]。在犬角膜内皮冷冻损伤模型中，ROCK抑制剂Y-27632恢复了角膜内皮细胞密度及离子泵功能[10]。同时有研究表明，ROCK抑制剂可以增加角膜内皮细胞的细胞连接蛋白ZO-1和离子转运蛋白Na+/K+-ATPase表达[11-12]，但对细胞增殖没有影响[12]。本研究中，B组与A组相比，细胞活力、迁移、黏附、增殖能力均下降，说明紫外线照射造成了RCECs损伤。与B组相比，C组细胞活力、迁移、黏附、增殖能力均增加，证明ROCK抑制剂Y-27632可以增强紫外线损伤的RCECs活性，促进细胞迁移、黏附和增殖，这与以往大多数研究结果相符[11-12]。

据报道，人角膜内皮细胞在整个生命过程中均处于细胞周期G1期，没有退出细胞周期[13]。细胞周期G1/S进程调节在细胞增殖中起重要作用。细胞周期蛋白CyclinD1是G1早期的一类正向调节蛋白，细胞周期性激酶抑制剂(CKI)与Cyclin/CDK复合物结合，使细胞周期进程被阻滞。p27是一种细胞周期性激酶抑制蛋白，抑制Cyclin/Cdk活性。本研究实时荧光定量PCR检测结果表明，C组的RCECs中CyclinD1 mRNA表达较B组上调，而CDKN1B(即p27kip1)的mRNA表达C组较B组下调；Western blot检查结果显示，C组的CyclinD1和Cdk2蛋白表达量均较B组上调，验证了基因上调的结果。说明ROCK抑制剂Y-27632通过下调CDKN1B的基因表达，解除CDKN1B蛋白对CyclinD1、Cdk2的抑制作用，促使RCECs突破细胞周期G1期进入S期，促进细胞增殖。这与Okumura等[14]的研究结果相符。

综上所述，ROCK抑制剂Y-27632对紫外线损伤的RCECs有保护作用，可增加细胞的迁移和黏附能力，通过调节CyclinD1和p27促进RCECs的增殖。本研究进一步明确了ROCK抑制剂的作用机制以及其在角膜内皮相关疾病治疗中的意义，为ROCK抑制剂治疗角膜内皮功能障碍的临床应用提供了依据。本研究不足之处为：未对ROCK抑制剂Y-27632对损伤的角膜内皮细胞的保护程度进行相应的比较或相关实验设计，后续实验可以进一步阐明。