不同波长人工发光二极管光照对大鼠视网膜的影响△

祝渊 陈松 王一鹏 杨文超 陈冬冬

人工发光二极管(LED)光源已被广泛应用到人们的日常生活及工作中，视网膜是否能长期耐受已引起视觉工作者的密切关注。研究发现[1]，光线因波长及强度的差异对视网膜组织代谢产生的影响也不相同，并检测到光损伤视网膜中自由基含量明显升高,继而引发视网膜视锥视杆细胞内外盘节的功能异常，造成视网膜视觉循环中间产物的异常堆积，最终引起视网膜感光细胞的凋亡。还有研究还指出，视网膜光化学损伤可能与老年性黄斑变性发病机制密切相关[2-3]。因此，研究视网膜光损伤并探索有效的预防措施对于防治相关疾病具有重要意义。本研究观察不同波长LED光源在不同光照强度(照度)条件下对大鼠视网膜的损伤情况，为不同波长的LED光源使用的安全照度和时间提供一定的参考资料。

1 材料与方法

1.1 动物来源3周龄雄性SD大鼠45只，体质量75～100 g，均购于北京维通利华公司。整个实验过程中大鼠在动物房分笼饲养，给予相同标准食物及水量，室温25 ℃左右，除实验特殊光照外，余光照均为日常自然光。本研究中实验动物大鼠的使用符合《眼科和视觉研究中使用动物的声明》(ARVO 2013年)。

1.2 实验材料本实验从苏州晶致医疗科技有限公司定制了光源为单波长红色LED(620 nm±10 nm)、绿色LED(520 nm±10 nm)、蓝色LED(460 nm±10 nm)和白色LED灯光(三色融合，色温3000 K)。每个光源独立开关控制，并可调节亮度。照度测量计确保同组大鼠受光照度暴露相同。光学手术显微镜(蔡司，德国)，石蜡切片机(莱卡，德国)；PARP抗体(1500～12000)、GFAP抗体(1500～12000)、β-actin抗体(13000～110 000)(Affinity，美国)，羊抗兔抗体(13000～110 000)、100 g·L-1预制胶、BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL显色试剂盒、磷酸化蛋白提取试剂盒(Solarbio，北京)；TUNEL凋亡染色试剂盒(碧云天，上海)。

1.3 方法

1.3.1 动物分组SD大鼠共45只，其中5只大鼠全程自然光下饲养作为空白对照组，其余按1000 lux照度和2000 lux照度分为两个大组，两组再根据接受光照不同分为红光照射组、绿光照射组、蓝光照射组和白光照射组(每组5只大鼠)，各光照组大鼠每天用相应波段光照射10 min，其余时间自然光下饲养。实验前大鼠置于黑暗环境中2周，以清除光暴露实验大鼠在以前饲养环境中的影响。

1.3.2 光照方式各组大鼠连续光照1个月。每只大鼠在光照时被安置在一个单独的透明管形装置，大鼠被放置在两侧灯架的中心， 光源设置在每个架子的内侧，距离每个光源15 cm，调节开关旋钮以获得不同照度的亮度。

1.3.3 各组大鼠视网膜TUNEL染色取各组大鼠左眼视网膜，40 g·L-1多聚甲醛固定后，常规梯度酒精脱水，二甲苯置换，石蜡包埋固定，做厚3 μm组织切片，常规脱蜡梯度酒精脱水后，滴加蛋白酶K室温消化30 min，PBS冲洗后滴加TUNEL检测液，37 ℃孵化60 min，PBS冲洗后滴加DAPI复染，PBS冲洗染色剂后封片，荧光显微镜下观察。

1.3.4 Western blot检测各组大鼠视网膜中PARP和GFAP蛋白的表达取各组大鼠右眼视网膜，冰上操作称取视网膜组织20 mg，剪碎后放入裂解液提取蛋白，超声粉碎后冰上孵育30 min，12 000 r·min-1离心30 min后取上清测定蛋白浓度，按14体积比加入4×蛋白缓冲液，沸水浴10 min冷却后等量(40 μg)上样。电泳(恒压140 V 50 min)，湿法转膜(恒压100 V，100 min)，洗涤后50 g·L-1脱脂奶粉中封闭2 h，根据Marker位置剪膜后封装一抗稀释液中摇晃过夜，再次TBST洗涤3次，室温下孵育2 h，加入按比例稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。TBST洗涤3次后，暗室曝光，采用ECL发光液(AB=11)显影。使用Image J软件行目的蛋白显影条带灰度分析，以确定各组大鼠视网膜中PARP和GFAP蛋白的相对表达水平。

1.4 统计学方法本研究利用SPSS 17.0软件包进行统计分析，各组大鼠视网膜不同因子蛋白的相对表达水平总体比较采用单因素方差分析，各光照组与空白对照组组间比较采用SNK法。检验标准：α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠视网膜TUNEL染色结果TUNEL染色结果显示，照度1000 lux时，红光、绿光、蓝光、白光照射组大鼠视网膜均未见明显的细胞核阳性染色(见图1)。照度2000 lux时，除空白对照组和红光照射组外，绿光、蓝光、白光照射组大鼠视网膜感光细胞层均可见细胞核的点状阳性着染，提示存在DNA的降解断端(见图2)。

2.2 各组大鼠视网膜中PARP和GFAP蛋白相对表达水平照度1000 lux时，各光照组与空白对照组相比，GFAP和cleved-PARP蛋白相对表达水平比较，差异均无统计学意义(均为P>0.05)(见图3、表1)。照度2000 lux时，蓝光照射组与空白对照组相比，cleved-PARP蛋白相对表达水平增加，差异有统计学意义(P<0.05)，红光、绿光、白光照射组与空白对照组相比，cleved-PARP蛋白相对表达水平差异均无统计学意义(均为P>0.05)；各光照组与空白对照组相比，GFAP蛋白相对表达水平差异均无统计学意义(均为P>0.05)(见图4、表1)。

图1 照度1000 lux时,各光照组大鼠视网膜TUNEL染色结果 各光照组大鼠视网膜感光细胞层均未见明显细胞核阳性染色。

图2 照度2000 lux时,空白对照组和各光照组大鼠视网膜TUNEL染色结果 空白对照组和红光照射组视网膜各层细胞核区域未见明显阳性染色细胞。绿光、蓝光、白光照射组大鼠视网膜感光细胞层细胞核区域可见散在的点状荧光染色，FICT图片中的带状绿色荧光为视蛋白的自发荧光。

图3 照度1000 lux时,Western blot检测各组大鼠视网膜中PARP和GFAP蛋白表达结果

图4 照度2000 lux时,Western blot检测各组大鼠视网膜中PARP和GFAP蛋白表达结果

表1 照度1000 lux和2000 lux时各组大鼠视网膜PARP和GFAP的蛋白表达

3 讨论

本研究选用SD大鼠作为实验动物，是基于啮齿类动物视网膜富含视杆细胞，在光损伤模型中，视杆细胞较视锥细胞更容易表现出光损伤，其主要机制可能与视杆细胞中负责将视黄醛代谢产物转运出视细胞的限速酶活性低于视锥细胞有关，并且视锥细胞除了经典的视细胞-RPE细胞的视黄醛循环途径以外，还具备自身内循环和有周边Müller细胞参与的部分视黄醛的代谢，所以相同照度下，视杆细胞更容易出现视觉循环中间产物的堆积，引发自由基损伤和醛类物质氧化损伤的大鼠视网膜感光细胞的需氧量比其他视网膜和中枢神经系统神经元的需氧量高[4]，其中线粒体簇负责葡萄糖高强度的氧化代谢[4-5]，导致了大鼠视网膜易受到线粒体代谢影响。而线粒体中的色素吸收峰值为400～450 nm[6-7]，且视紫红质及叶黄素的吸收峰值分别在500 nm和450 nm[7]，都在可见光范围内，容易受到光照影响导致光损伤。

在视网膜光损伤中，普通认可的是基于光诱导的全反式视黄醛，这是光转导级联产物之一。全反式视黄醛的加工及其向11-顺式-视黄醛生色团的转化对于感光器的生存至关重要[8-9]。感光细胞中游离的全反式视黄醛的积累介导了氧化应激的产生。当光继续照射这些光感受器时，会通过产生超氧自由基和其他活性氧(ROS)引起损伤[8,10]。Sundar等[11]研究证实，光诱导的光感受器细胞凋亡是由视紫红质信号转导介导的，视紫红质信号转导是独立的，并影响cGMP门控的阳离子通道。这些会导致Ca2+在细胞中的积累和由于氧化应激诱导的光感受器变性。同样，线粒体是钙中毒[12]和ROS产生的主要场所之一。许多研究发现，感光细胞的凋亡伴随着不同来源的视网膜ROS成分含量升高[13]。这促使氧化应激反应增加，并加剧了感光细胞的变性[14-15]。ROS可与大分子相互作用，包括脂质、蛋白质或DNA，从而引起细胞功能障碍和死亡[16]。此外，视网膜中一氧化氮(NO)含量高，它是一种广泛存在的神经递质[17]。但是，NO也可能与氧或超氧阴离子相互作用，产生极具神经毒性的活性氮物质(RNS)[18]和过氧亚硝酸盐[19-20]。Kutsyr等[14]研究表明，光损伤早期首先发生在视网膜外层，即感光细胞内节和外节部位，可在较早期出现氧化应激反应。由于自由基、ROS及RNS堆积，视黄醛光异构化和线粒体代谢异常，免疫荧光染色可见异常荧光分布[21-22]。在所有视网膜退行性疾病中，光感受器变性伴随小胶质细胞的增殖和活化，并伴随着免疫细胞作为单核细胞和巨噬细胞的募集，使组织处于活跃的炎症状态[23-24]。最终引起光感受器变性，进而演变为广泛的视网膜结构重塑[25]。

本研究检测的目标蛋白为被上游caspase-3切割活化的PARP片段(cleved-PARP)，其表达量与组织细胞凋亡呈正相关[26]。PARP是一种多功能蛋白质的修饰酶，存在于多数真核细胞中，它通过识别结构损伤的DNA片段而被激活，同时PARP又是细胞凋亡核心成员caspase的切割底物[27-28]。GFAP为视网膜早期修复时高表达的蛋白之一，其表达量的高低提示视网膜组织是否开始进行损伤后组织修复[29]。

本研究中结果显示，照度2000 lux光照1个月时，TUNEL染色结果提示，除了红光照射组外，蓝光、绿光、白光照射组大鼠视网膜感光细胞层均出现散在的阳性细胞染色，蓝光照射组大鼠视网膜感光细胞层阳性染色更明显，但Western blot检测结果显示，只有蓝光照射组cleved-PARP蛋白相对表达水平高于空白对照组，且差异有统计学意义(P<0.05)，绿光照射组和白光照射组cleved-PARP蛋白相对表达量高于空白对照组,但差异均无统计学意义(均为P>0.05)。可能的原因是实验中给出的蓝光波长中心值在465 nm，最接近线粒体中色素光谱吸收峰值[7,30]。可见光光谱的一部分蓝光可以被线粒体呼吸链发色团吸收，从而引起线粒体动力学的破坏以及ROS的增加[7,31]。而实验光源红光(中心波长620 nm)和绿光(中心波长525 nm)偏离线粒体色素吸收峰值。另有研究表明[7,14,32-33]，红光照射可以促进线粒体呼吸链的电子传递速度，从而增加损伤情况下线粒体膜电位的稳定性，减少线粒体源性的自由基释放，相对于短波长，相同照射剂量的红光更难造成光损伤。绿光虽然波长更加接近视紫红质的吸收峰值[7]，但是本研究中并未见绿光照射组大鼠视网膜凋亡蛋白的表达上调，但是可以看到部分绿光照射组大鼠视网膜TUNEL染色的阳性细胞，白光照射组出现的情况与绿光照射组相似，这种情况一方面可能因为凋亡出现在少量视细胞中，cleved-PARP并不能敏感地表达上调，其他相关损伤蛋白可能会有表达改变，另一方面，不排除部分组织片出现假阳性染色的可能。照度2000 lux 光照时，各组大鼠视网膜中GFAP蛋白均未出现明显的表达上调，提示视网膜神经胶质细胞并未发生大量激活、迁移及增殖，各光照组光损伤均未进入明显的凋亡修复时期。照度1000 lux光照1个月时，TUNEL染色提示各光照组大鼠视网膜均未发现明显阳性染色细胞，Western blot检测各组大鼠视网膜中cleved-PARP和GFAP蛋白相对表达水平均未见明显差异(均为P>0.05)，提示照度1000 lux每天10 min光照1个月时，红光、绿光、蓝光、白光各光照组大鼠均未出现明显视网膜光损伤表现。在Jaadane等[34]的研究中，使用市售白色LED灯光(功率5 W)照射的大鼠也出现了典型的细胞凋亡特征，他们的光照方案采取的是将光源悬挂于笼顶部上方25 cm，在不预先适应黑暗的情况下，连续将大鼠暴露在光源下6 h甚至更长时间。而本研究中每次光照时间较短(每天只有10 min)，以便控制大鼠实际所受的光照强度稳定并在大鼠耐受范围，并把照射周期延长为 1个月，因此不同的光照方案和光照时间可能是结果差异的原因。

由于本实验的周期及人力有限，我们只选取了具有代表性的凋亡损伤蛋白PARP和GFAP作为目标蛋白检测，未能进行更大样本量及更长时间的追踪和重复研究，取得的实验结果可能因样本量的原因出现一定的统计误差和选择偏倚。此外，低照度光照对大鼠视网膜可能存在的累积效应需要更长的照射周期。通过本研究，也侧面提示了在分析视网膜光损伤时，不能从日常暴露中排除慢性影响的风险，因为低照度的LED可能不会诱发急性视网膜光损伤综合征，但由于可能存在的累积效应，是否会导致感光细胞慢性缺失还有待今后进一步研究。

致谢：感谢刘文陆博士在本研究中给予的支持和帮助！