青光眼发病机制相关分子途径研究进展△

刘宇航 毛小雪 牛媖 刘思源 任婉娜

青光眼是以视野缺损、视力下降、神经节细胞不可逆性凋亡为主要特征的神经退行性疾病。作为全球第一大不可逆致盲眼病，估计 2040 年全球患者数将达 1．118 亿[1]。由于其进展隐匿，损失的视力往往不可恢复，被称为“视力的小偷”。目前关于青光眼的发病机制有多种说法，如：表观遗传调控、细胞凋亡机制、氧化应激损伤、β淀粉样蛋白的神经毒性作用等，但尚无一个确切的分子通路可以完全解释青光眼的发病机制。在治疗上，目前临床上主要以药物、手术或联合多种方式降低眼压，辅以营养神经等，手段较为单一，部分患者疗效不显著。本综述列举近年青光眼发病机制相关分子途径，期待针对这些途径通路的阻断剂能成为未来青光眼靶向治疗药物研发的新方向。

1 表观遗传调控与青光眼

表观遗传学的概念由Waddington于1942年提出，是指在DNA核苷酸序列不发生改变的情况下，基因的表达产生了可遗传的改变[2]。表观遗传学主要机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰以及微小RNA (micro-RNA，miRNA)。表观遗传学理论认为青光眼是一种遗传和环境综合作用的复杂疾病，环境因素可以通过表观遗传调控的方式作用于基因组DNA，调节基因的表达，产生长期的表型改变，并最终导致疾病的发生[3]。

1.1 DNA甲基化和青光眼DNA 甲基化指在 DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT) 的催化下，S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM) 的甲基被转移至DNA序列上的过程，DNA 甲基化是一种稳定的基因沉默机制，可以通过改变 DNA 结构，排斥转录激活因子，阻遏转录[4-5]。对于哺乳动物，DNA 甲基化主要发生于胞嘧啶 C-磷酸 p-鸟嘌呤G(CpG)二核苷酸的胞嘧啶残基，生成产物为 5-甲基胞嘧啶(5-mC)[6]。Burdon等[7]进行的一项病例对照研究发现，CDKN2B 启动子区域的一个 CpG 位点的甲基化水平与正常眼压性青光眼(normal tension glaucoma，NTG) 明显相关。DNA 甲基化水平异常导致眼组织异常纤维化主要与转化生长因子 β(TGF-β) 信号通路异常相关。TGF-β 信号通路异常激活可导致细胞外基质过度堆积，改变细胞骨架结构和细胞间距，使小梁网和筛板纤维化，影响房水外流，同时也可导致筛板区域僵硬，使得视神经更容易在高眼压的作用下受到损伤[8]。使用DNA 甲基化抑制剂5-氮杂胞苷处理青光眼患者小梁网可使小梁网纤维化水平降低[9]。提示DNA甲基化可能与青光眼小梁网损伤机制相关。

1.2 组蛋白乙酰化和青光眼组蛋白的乙酰化是最重要的组蛋白修饰机制之一，乙酰化可以消除赖氨酸残基的正电荷，干扰组蛋白和DNA 之间的相互作用，使染色质稳定性降低，有利于激活转录； 而组蛋白去乙酰化则增加染色质稳定性，抑制转录[10-11]。使用组蛋白去乙酰化抑制剂(TDP-A)处理灌注离体培养的牛眼后，TGF-β2 表达水平升高，细胞骨架蛋白、细胞外基质增加，眼压增高。因此，组蛋白高乙酰化可能与青光眼小梁网损伤机制相关[12]。

1.3 miRNA和青光眼miRNAs 是含有18～20个核苷酸的短链非编码RNA，miRNA与目的基因信使 RNA(mRNA)的 3’非翻译区(3’UTR) 结合后，介导mRNA降解或转录后水平的基因沉默，在肿瘤发生发展、生物发育、器官形成、病毒防御、表观调控以及代谢等方面均发挥重要作用[13-14]。据估计,miRNA占人类基因组的 1%～5%,高达 60%的蛋白质编码基因在转录后水平受到 miRNA的调控[15-16]。Ghanbari等[17]进行的一项全基因组 miRNA相关基因位点变异的研究显示，原发性开角型青光眼(primary open-angle glaucoma，POAG) 与对照存在 411 个 miRNA位点变异，另外有 47 个 miRNA结合位点的变异与POAG表型显著相关，其中2个变异位点分别影响了miR-138-3p 和 miR-323b-5p 对 CDKN2B的调节作用[17]。

2 视网膜神经节细胞凋亡与青光眼

青光眼患者中，导致细胞损伤的因素，如高眼压、血流动力学障碍、氧化应激损伤和炎症反应、兴奋性谷氨酸毒性作用、神经营养因子缺乏等均可作为凋亡调控相关信号导致视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell，RGC)凋亡。细胞凋亡是细胞受到致死因素后的程序性死亡，主要通过死亡受体途径、线粒体途径、内质网途径发生。但参与RGC凋亡的具体分子信号途径目前尚未明确，探索分子途径上下游信号及其作用尤为重要[18]。

2.1 死亡受体途径包括凋亡相关因子(factor associated suicide，Fas)和肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor，TNFR)。

2.1.1 Fas受体通路Fas(CD95)是TNF /NGF受体家族的膜蛋白，相应的 Fas 配体(Fas ligand，FasL)属于胞外TNF超家族成员，在免疫豁免位置如眼上表达。FasL结合凋亡细胞上表达的受体 Fas三聚化并活化，通过Fas相关死亡结构域蛋白(Fas associated death domain，FADD)募集衔接蛋白。衔接蛋白可通过死亡结构域与caspase-8前体(pro-caspase 8)形成由FasL-Fas-FADD-procaspase-8串联构成的死亡诱导信号复合物(death-inducing signal complex，DISC)。在DISC内，高浓度的procaspase-8可以自我剪接和活化，然后释放到细胞质并启动caspase级联反应，导致细胞凋亡。

2.1.2 TNFR通路TNF 结合TNFR之后发生三聚体化，然后招募1个衔接蛋白肿瘤坏死因子受体 Ⅰ 型相关死亡结构域蛋白(tumor necrosis factor receptor type 1-associated DEATH domain protein，TRADD)。TRADD 可以再招募其他3个衔接分子：FADD(即Fas/FasL 通路中的 FADD 分子)、肿瘤坏死因子受体相关因子 2(tumor necrosis factor receptor-associated factor-2，TRAF-2)和受体相互作用蛋白(receptor interactive protein，RIP)。如果 TRADD 和 RIP/TRAF-2 相互结合，下游激活 NF-κB 通路或者 JNK/AP-1 通路；如果TRADD 和 FADD 相互结合，那么下游可以招募和活化caspases，并激活凋亡通路。

2.2 线粒体途径线粒体被认为是处于凋亡调控的中心位置，死亡信号激活含BH3结构域的Bcl-2 家族成员，例如 Bax发生寡聚化并插入线粒体膜，引起线粒体膜通透性改变，跨膜电位丢失，释放细胞色素C(Cyt C)和其他蛋白。Cyt C 与凋亡蛋白酶活化因子 (apoptotic protease activating factor，Apaf-1)形成多聚复合体，通过Apaf-1 氨基端的 caspase 募集结构域 (caspase recruitment domain，CARD)，募集细胞质中的caspase-9 前体，并使其自我剪切活化，然后启动caspase级联反应，激活下游的caspase-3和caspase-7，完成其相应底物的剪切，引起细胞凋亡。

2.3 内质网途径凋亡的内质网通路和线粒体通路或死亡受体介导的凋亡通路有很大的不同。当内质网内钙离子平衡被破坏或者细胞质的caspase-7 转移到内质网表面，都会诱导caspase-12 在内质网膜上的表达，激活后的caspase-12 可进一步剪切caspase-3，引发细胞凋亡。

3 氧化应激损伤与青光眼

氧化应激是一种生理适应机制，反映了活性氧的产生和抗氧化防御之间的不平衡。大多数生物，从细菌到人类，利用氧化应激来应对环境挑战。与人类常见的由下丘脑、垂体和肾上腺调节的应激不同，其是由所谓的氧化还原系统控制的，氧化还原系统通过调节细胞信号、防御和解毒作用，在细胞稳态和生存中发挥关键作用。氧化应激是一种新兴的健康危险因素，它与早期衰老和常见疾病，尤其是青光眼有关，没有任何临床表现。抗氧化家族包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶和硫氧还蛋白等；外源性化合物如维生素和类维生素的抗氧化化合物，如多酚类、寡聚体等，二者都具有清除自由基、修复或自适应功能，这些物质均匀地分布在生物体内部[19-20]。

人眼房水流出通道更容易受到氧化损伤，其中房水流出通道包括2个屏障：小梁网细胞屏障和Schlemm管内皮细胞屏障，氧化损伤主要通过影响内皮细胞来达成青光眼不良事件。目前尚不清楚氧化损伤是由于抗氧化防御减少还是由于线粒体的主要损伤[21]。在青光眼进程中，小梁网相当于一个高度老化的组织：氧化DNA损伤与自噬激活之间存在显著的关系，这是一种溶酶体降解途径，对小梁网细胞的存活和稳态至关重要。慢性氧化暴露导致溶酶体碱化和溶酶体酶的蛋白水解激活不足，从而降低自噬通量。 这可能是小梁网进展性年龄相关细胞功能衰竭的因素之一，也许有助于解释POAG的发病机制[22-23]。因此，具有抑制氧化应激功能的某些物质，可能成为未来青光眼治疗的新方式，如：凋亡信号调节激酶1、致胞质分裂因子3、丙戊酸、亚精胺、坎地沙坦、核因子红系2相关因子2等[24]。氧化应激的增加和衰老相关，并且在神经退行性疾病和神经炎症的发病机制中起重要作用。随着全球预期寿命的急剧增加，迫切需要治疗或管理与年龄相关的慢性神经退行性疾病，如青光眼、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)和帕金森病[25-26]。

4 β淀粉样蛋白与青光眼

眼是脑的延伸，眼在胚胎发育过程中由前脑神经褶到视泡、视杯再到分化形成完整的结构，是脑部外延的一个特殊感光器官。AD是世界性痴呆的主要原因，是一种以慢性隐匿性认知相关功能障碍为表现，以神经原纤维缠结、神经元死亡为特征的神经退行性疾病。青光眼与AD同为神经退行性病变，流行病学研究表明，与一般健康人群相比，更多的AD患者可能患有青光眼，RGC损伤是这2种疾病的特征，同时在视网膜和眼房水中检测到β淀粉样蛋白和tau蛋白沉积，这2种蛋白被认为是AD的病原体。目前对于β淀粉样蛋白在青光眼中的神经毒理作用的研究还有很多缺失的环节尚不明确，但对于未来青光眼的治疗提供了新的方向和可能。

4.1 AD和青光眼的相关流行病调查AD是世界范围内引起老年人痴呆的主要病因，其主要危险因素是年龄。青光眼是以视野缺损、视力下降、RGC不可逆性凋亡为主要特征的神经退行性疾病，二者均为神经退行性疾病[27]。近年来，越来越多的学者聚焦于AD和青光眼之间的联系。Bayer等[28]研究发现，在112例德国AD患者中有29例发现视野缺陷和杯盘比>0.8，青光眼患病率为25.9%，而对照组为5.2%，西方国家青光眼调查中发现的青光眼患病率为2.6%～4.7%，AD患者有更大的概率患上青光眼。Yochim等[29]评估了41例青光眼患者[年龄为(70.0±9.2)岁，其中70%为女性]的认知状态。在对年龄进行控制后进行痴呆问卷调查，其中44.0%的患者表现出轻度的认知障碍，而12.2%的患者表现出轻至中度的认知障碍。近年来，Lin等[30]研究也表明，AD和POAG存在关联，其在随访8 a的回顾性研究中将1351例年龄>65岁的中国台湾AD患者青光眼的患病率与5329名非痴呆对照组进行了比较，发现POAG组和非POAG组AD的发生率和置信区间分别为每周每1000人中2.85 (95%CI 2.19～3.70)和1.98 (95%CI 1.68～2.31)，POAG可作为AD的显著预测因子，二者有明显关联。然而，关于AD和青光眼的联系也有相反的结论，Bach等[31]对丹麦69例NTG患者进行了平均时长12.7 a的随访，发现他们中没有患者出现AD，并认为AD和NTG二者没有关联。

4.2 AD和青光眼相关的病理表现AD是一种起病隐匿、慢性进展的神经退行性病变，其脑组织病理表现为：皮质和海马区神经元细胞凋亡、β淀粉样斑块、神经纤维缠结和视网膜空泡变性[32-34]。这一系列病理变化最终会导致脑萎缩和认知功能进行性下降。目前为止，尚无有效标记方法可以有效检测AD，而由于AD的视网膜表现及眼和脑在某些程度上有一定的相似之处，非侵入性的视网膜成像技术或许能成为检测轴突健康状态的有效手段。光学相干断层扫描(OCT)目前被广泛应用于黄斑和视盘病变的检测，可以分别分析视网膜的各个层厚度。Ascaso等[35]在一项横断面研究中选取了41名健康对照者，18例AD患者以及21例轻度认知功能障碍(mild-cognitive-impairment，MCI)患者，所有患者均行OCT测量视盘及黄斑区周围视网膜神经纤维层(thickness of peripheral retinal fiber layer，RNFL)厚度，发现AD患者的RNFL明显小于MCI患者，而MCI患者的RNFL明显小于健康对照。RNFL厚度变薄被认为是神经节细胞凋亡的继发性改变，而这正是青光眼表现的终点[36]。视神经轴突的变性及RGC细胞数量的减少导致青光眼特征性视盘的形成。而RGC的损伤是通过细胞凋亡、氧化应激、线粒体功能障碍、兴奋性毒性和胰岛素抵抗等多种途径联合作用而发生的[37-39]。β淀粉样蛋白作为一种已知的神经毒性肽，AD的病因之一，可能参与了青光眼RGC的凋亡过程。

4.3 β淀粉样蛋白的神经毒性作用β淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)是由和β和γ分泌酶分泌的一类跨膜糖蛋白，可产生具有细胞毒性的β淀粉样蛋白(beta-amyloid,Aβ)。其中APP的功能尚不完全清楚，除了产生具有细胞毒性的Aβ之外，由α分泌酶分泌的可溶性APP(sAPPa)具有一定的神经保护作用[40]。Aβ的存在形式分为可溶性的单体、寡聚体和不溶性的纤维状斑块，Aβ单体相互聚集形成Aβ寡聚体，Aβ寡聚体进一步聚集形成Aβ斑。从组织学角度看，AD的两个主要特征是Aβ斑块和神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)，后者主要由高磷酸化的tau蛋白组成，这是一种微管相关蛋白(MAP)，对维持神经极性和结构至关重要[41]。已有研究表明，Aβ的积累可导致微管tau蛋白的解体，并促进其过度磷酸化[42-43]。tau蛋白的过度磷酸化及其随后的低聚作用导致细胞内NFTs的形成，最终，细胞毒性NFTs与寡聚物Aβ协同作用，导致突触功能障碍和轴突缺失[44-45]。Aβ寡聚物发挥神经毒性作用的细胞机制是多方面的，包括突触毒性和线粒体功能障碍，可能与氧化应激和代谢障碍有关。突触毒性作为Aβ的一个突出特性，通过Aβ体外处理大脑或者海马区神经元的部分相关研究表明，Aβ低聚物可通过减少突触处的α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酮酸(AMPA)和N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体数量来减少谷氨酸能突触传递[46-49]。根据突触类型、神经元类型和大脑区域的不同，Aβ可能对突触活动产生不同的影响，导致神经元网络的不平衡和不稳定[50]。在细胞水平，Aβ介导的改变包括向兴奋性增强的转变，表现为神经元膜的静息电位降低[51]。在大脑中，可溶性Aβ肽在线粒体内的积累可抑制不同呼吸酶的活性，导致ATP产生减少，增加活性氧自由基的产生，并损害线粒体膜的通透性[52-55]。线粒体功能障碍是各种神经退行性疾病的共同特征，细胞内Aβ与轴索病和凋亡启动相关[56-57]。而在神经元中，线粒体功能障碍也与兴奋性毒性的易感性增加有关(如兴奋性氨基酸，如谷氨酸对神经元的过度刺激导致细胞死亡)[58]。不溶性Aβ聚集物也可直接通过释放可溶性寡聚物[59]，或通过自适应细胞反应，如神经胶质和内皮细胞的激活来间接导致细胞毒性，这2种方式分别可导致神经炎症[60]和与Aβ相关的血管病变[61]。当然，目前对于Aβ神经毒性的研究更多的是针对脑神经元，而AD患者死后的视网膜中可检测出Aβ沉积，且青光眼患者的房水和玻璃体中均有检测出Aβ，因此通过视网膜神经纤维层的影像学检查可以对AD患者进行很好的早期监测，而针对Aβ神经毒性作用的药物有可能成为未来青光眼治疗方面的研究方向，Aβ对视网膜神经纤维的具体作用机制尚不明确，有待于进一步研究[62-63]。

4.4 Aβ与青光眼青光眼是一组以视神经退行性病变为特征的疾病，伴有RGC的丢失。青光眼被认为会通过RGC死亡引起视野收缩和视力下降。虽然眼压升高是青光眼的一个已知危险因素，但20%～90%的患者是NTG[64-66]。无论是近年来流行病学的相关研究，还是Aβ在神经退行性疾病中的作用机制研究，无一不表明Aβ也参与了RCG的死亡。已经证实青光眼小鼠中确有视盘Aβ的沉积和APP活动的增加[67]。Tsuruma等[68]使用Aβ的神经毒性片段Aβ25-35处理原代培养小鼠皮层神经元及RGC-5细胞，发现细胞以浓度依赖和时间依赖的方式死亡，而淀粉样前体蛋白敲除抑制AP25-35诱导的细胞死亡，β和γ分泌酶抑制剂也可以减少细胞死亡。Mohd Lazaldin等[69]发现，玻璃体内注射Aβ1-40对大鼠视网膜及视神经的损害呈浓度依赖和时间依赖，Aβ1-40诱导的损伤与视网膜氧化应激增加和视网膜脑源性神经营养因子水平降低有关。Lin等[70]发现，向小鼠玻璃体内注射Aβ1-42可通过激活补体系统诱导小鼠视网膜炎症反应和功能障碍。目前世界上关于Aβ对视网膜细胞损伤的研究较之对脑神经元损伤尚且不足，二者损伤机制是否会有不同有待进一步研究证实。当前仅有研究证据肯定了Aβ在实验动物体内以时间依赖和剂量依赖的方式诱导RGC凋亡。与此同时，针对Aβ途径的靶向治疗为青光眼的治疗提供了一种新的思路，有希望替代传统的青光眼控制眼压治疗：(1)β或γ分泌酶抑制剂减少Aβ生成；(2)Aβ抗体减少Aβ在视网膜的沉积；(3)抑制Aβ的聚集和神经毒理作用。Li等[71]发现，在慢性青光眼大鼠模型中Aβ1-42和Aβ25-35在3 d时诱发的RGC凋亡达到巅峰，且在低浓度时Aβ1-42毒性更大。在预防RGC凋亡疗效方面，Li等[71]发现，3种针对Aβ不同途径的药物均有效果，其中Aβ抗体(Aβantibody,Aβab)疗效优于β分泌酶抑制剂(βsecretase inhibitor,βSI)和刚果红(congo red,CR)，且在眼压开始升高的早期阶段给药优于眼压升高后2周给药，联合用药优于单药应用。Aβab可以清除Aβ并减少其聚集，βSI是一种膜锚定天冬氨酸蛋白酶，负责类淀粉途径中APP裂解的起始步骤，可抑制Aβ的产生，CR则通过干扰蛋白质的错误折叠和阻止离子通道的形成来阻止Aβ的聚集和神经毒性。近年相关文献研究证明，AD和青光眼同为神经退行性病变，二者可能存在某种特殊的联系[27-31]，而Aβ被证实在其中具有至关重要的作用。目前关于Aβ对于眼部的神经毒理作用尚不明确，且研究较Aβ对于脑部神经毒理作用的研究更少，但无可否认，青光眼RGC凋亡有Aβ的参与，且动物实验中针对Aβ不同途径的阻断药物的确可减少青光眼大鼠RGC凋亡，针对Aβ途径的药物有可能成为未来青光眼治疗新的研究方向之一。