肖丹 兰长骏 杨琴 刘阳 谭青青 廖萱
近视是最常见的一种屈光不正,它的发病率和严重程度正在逐年增加。预计到2050年近视患者将达到世界人口的49.8%,且近10.0%的人将会成为高度近视[1]。目前人们普遍认为近视是一种遗传和环境因素共同作用的复杂疾病。近年来,科研人员利用全基因组关联分析(genome wide association study,GWAS)进行了大量的研究,成功鉴定了新的近视易感基因座[2-3],也对近视相关的环境因素[4-5]进行了分析。GWAS的研究结果表明,光依赖性视网膜-巩膜信号转导会引起屈光不正,进一步证实了近视的“视网膜局部调控学说”[6]。另有研究发现,在近视发生发展的过程中,作为信号中继站的视网膜色素上皮(RPE)和脉络膜[7],以及作为重要信号分子的视黄酸都发挥重要作用[8]。
视黄醇脱氢酶5(RDH5)基因为视黄酸代谢相关基因,主要表达于RPE细胞并参与视觉循环中11-顺-视黄醇的循环。研究人员基于大规模近视GWAS所得数据[9-10],利用生物信息学方法在近视显著关联的遗传易感基因区域及位点中鉴定出潜在的功能变异RDH5 rs3138144,其等位基因频率分布在近视组与对照组之间的差异有统计学意义,并且多项生物信息学证据支持其具有功能效应[11]。本研究进一步调查近视相关基因RDH5内含子区单核苷酸多态性(SNP)位点rs3138144(G>C)对其启动子功能的影响,探讨RDH5基因表达调控的分子机制,以期为近视发病机制的研究提供参考资料。
1.1 材料
1.1.1 细胞及质粒人RPE细胞株ARPE-19(四川大学华西医院),人肾上皮293T细胞系HEK293(川北医学院转化医学实验室),DH5α大肠杆菌细胞株(天根生物公司),双荧光素酶报告载体pGL3-Basic 和pRL-TK(Promega公司)。
1.1.2 主要试剂限制性核酸内切酶试剂盒(美国Thermo fisher公司),DNA聚合酶试剂盒(美国NEB公司),双荧光素酶报告基因分析系统试剂盒(Promega公司),X-tremegene HP DNA Transfection Reagent试剂盒(瑞士罗氏公司),优质胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),QIAquiek Nucleotide Removal Kit及Quigen Plasmid Midi Kit试剂盒[安诺伦(武汉)生物科技有限公司],质粒提取试剂盒(中国天根生化科技有限公司),基因组DNA提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 RDH5启动子及其SNP位点的双荧光素酶载体构建将RDH5基因(NC_000012.12)中从初始密码子ATG往前扩增1500 bp的5’端上游调控区域作为拟研究的启动子片段,以包含rs3138144位点的长220 bp的区段作为研究的内含子片段。利用Primer Premier 5.0设计引物,上游引物为5’-GATAGGTACCAATACGCCTGGCATCCAAG-3’,下游引物为5’-GATCTCGAGAGCTGGAGCCCAAGTGAC-3’,扩增出含rs3138144 G/G基因型内含子片段。另取同一人类基因组 DNA 为模板,设计引物,上游引物为5’- CAAATACAGCGTCTGCCCACATCTTTGC-3’,下游引物为5’- CAGACGCTGTATTTGTGGCTAACTTAAC-3’,扩增出含rs3138144 C/C基因型内含子片段。随后,95 ℃预变性 5 min,94 ℃变性 30 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸50 s,30个循环;72 ℃再延伸5 min。之后将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行分析。测序正确的DNA扩增片段与pGL3-Basic进行酶切及DNA连接,得到荧光素酶表达载体rs3138144荧光素酶报告基因质粒野生型(pGL3-RDH5-G)和rs3138144荧光素酶报告基因质粒突变型(pGL3-RDH5-C),转化大肠杆菌DH5α感受态,氨苄青霉素筛选,阳性克隆重组质粒回收后经双酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序验证。
1.2.2 转染细胞及双荧光素酶相对活性检测取细胞融合度约60%的ARPE-19细胞及HEK293细胞,使用X-tremegene HP DNA Transfection Reagent进行瞬时转染。将pGL3-RDH5-G、pGL3-RDH5-C与pRL-TK共转染;同时设定pGL3-Basic作为对照;再设定一孔细胞单独转染绿色荧光蛋白质粒以控制转染效率。转染48 h后进行荧光素酶相对活性测定,使用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性比值来表示启动子的转录活性。
1.2.3 电泳迁移率变动分析合成包含RDH5内含子区候选功能SNP在内的约25 bp大小的核苷酸序列作为探针(见表1),用荧光素标记探针5’末端,通过寡核苷酸退火形成双链结构并进行纯化。按照核蛋白抽提试剂盒说明书抽提ARPE-19细胞核蛋白进行DNA-蛋白结合反应。反应完成后,将电泳获得的胶块取出并避光,置于BIO-RAD chemi-DOC中进行荧光成像。
1.3 统计学方法使用SPSS 23.0统计学软件和GraphPad Prism 6.0进行统计分析与绘图。计量资料均采用均值±标准差表示,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。电泳迁移率变动分析条带使用Image J 1.8.0软件进行灰度值分析。检验水准:α=0.05。
2.1 RDH5基因启动子区重组质粒结果验证成功克隆到1500 bp长度的RDH5启动子片段,以 ARPE-19细胞总DNA为模板,PCR扩增电泳结果显示目的片段大小约1500 bp,与预期结果一致,克隆成功(图1)。
图1 RDH5基因启动子片段琼脂糖凝胶电泳检测结果
2.2 RDH5基因内含子区重组质粒测序结果将构建的pGL3-RDH5-G/C重组质粒进行DNA测序,测序结果与GeneBank中RDH5基因启动子区序列一致,两种重组质粒在-200位点碱基分别为G和C,存在一个碱基差异(图2)。
2.3 rs3138144位点荧光素酶相对活性将重组质粒pGL3-RDH5-G、pGL3-RDH5-C、空质粒pGL3-Basic分别与内参质粒pRL-TK共转染于ARPE-19细胞和HEK293细胞。重组质粒荧光素酶相对活性参考对照进行校正。在ARPE-19细胞中,野生型rs3138144位点荧光素酶相对活性为0.806±0.156,突变型为0.525±0.130,对照为0.085±0.027,野生型荧光素酶相对活性高于突变型及对照,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。在HEK293细胞中,野生型rs3138144位点荧光素酶相对活性为0.075±0.013,突变型为0.040±0.006,对照为0.004±0.001,野生型荧光素酶相对活性高于突变型及对照,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。
2.4 rs3138144不同等位基因与核蛋白结合能力差异rs3138144位点不同等位基因与核蛋白结合的电泳迁移率变化分析结果见图3。图中泳道2与泳道6形成了结合条带,表明等位基因G及等位基因C均能与核蛋白中的某种转录因子结合,灰度值分析结果提示,等位基因G结合能力更强;泳道3随着G型冷探针的加入,结合条带逐渐消失,而加入C型冷探针的泳道4,结合条带却没有明显变化;泳道7随着G型冷探针的加入,结合条带明显消失,而加入C型冷探针的泳道8,结合条带变淡。说明G等位基因的结合为特异性结合。
图3 rs3138144位点不同等位基因与核蛋白结合的电泳迁移率分析结果
全基因组关联分析和外显子测序已经成为寻找近视或屈光不正致病基因的主要手段。GWAS鉴定出的新近视易感基因RDH5位于12号染色体长臂,由4376个碱基对组成,编码的RDH5为含318个氨基酸的同型二聚体,特异性以11-顺式-视黄醇、9-顺式-白藜芦醇和13-顺式-视黄醇作为底物,主要产物是在视觉周期中起关键作用的11-顺式-视黄醛[12]。人RDH5基因的突变常导致视杆细胞及视锥细胞感光色素再生延迟[13]。
近年来,新的RDH5基因突变位点及其相应的视网膜病变表型相继被报道,提示RDH5在维持RPE和光感受器功能方面扮演着重要角色[14-16]。Sergouniotis等[17]通过对8个先天性夜盲症家系中9例患者进行研究,发现患者的视网膜电流图均显示中度至重度视杆细胞功能障碍,推测可能由RDH5基因突变导致类视黄醇衍生的荧光团缺乏所致。类视黄醇是一大类聚异戊二烯脂质,调节脊椎动物多种重要的生物学过程,如胚胎发育、细胞增殖、分化和凋亡,以及维持机体稳态等[18]。类视黄醇包括视黄醇及其天然和合成衍生物视黄醛、视黄酸等,各种结构间通过体内视黄醇脱氢酶类的催化反应相互转化。近年来大量研究表明,近视患者的眼轴增长与视黄酸关系密切。此外,Mao等[19]发现在负透镜诱导的光学离焦性近视豚鼠中,视网膜、脉络膜视黄酸表达均升高;McFadden等[20]研究发现,在形觉剥夺性近视豚鼠的视网膜中视黄酸含量升高。最近,Liu等[21]通过共定位RPE定量性状位点与近视GWAS候选基因,发现RDH5基因位点与近视存在关联。
然而GWAS已经确定的许多与疾病和性状相关的非编码变异仅是直接功能性变异所在的单倍型的“标签”[22],而从相关标签SNP里找到功能性致病变异以及相关候选基因则成为了研究工作的难点[23]。SNP是人类可遗传变异中最常见的一种,在人类基因组中广泛存在,已成为当今基因组研究的主要遗传标记方法[24]。基于93%以上的SNP位于编码序列之外,如基因间和内含子区域,揭示出非编码区域可能是大量遗传信息发挥作用的关键[22]。近年来人类基因组研究加深了人们对这些位于非编码序列的SNP对基因表达调控的认知,如通过改变调控元件、拼接模式、外显子的上游和下游的拼接增强子、内含子的拼接增强子等影响基因的转录过程,进而改变mRNA的转录及表达,影响下游蛋白质的表达和功能,最终可能造成个体对疾病易感性的差异。由于非编码区(启动子或内含子区域)的关联位点SNP等位基因的差异无法在mRNA得到反映,通常以该SNP位点附近序列为对象,通过报告基因研究不同等位基因对该序列启动子活性的影响,或通过电泳迁移率变动分析不同等位的寡核苷酸探针结合核蛋白或转录因子能力的差异。rs3138144位点位于RDH5基因的内含子区域,通过影响pre-mRNA的剪接或影响基因启动子转录活性参与基因的表达调控[25]。
本研究通过将含rs3138144位点G等位基因的人RDH5启动子片段克隆入pGL3-Basic载体,成功构建了RDH5基因内含子区多态位点pGL3-RDH5-G载体,通过点突变得到pGL3-RDH5-C载体,将构建的重组质粒和内参质粒(pRL-TK)共转染ARPE-19与HEK293两种细胞,结果显示两种重组质粒的细胞裂解液荧光素酶相对活性与空载质粒相比均明显增强,表明该RDH5基因启动子片段在ARPE-19细胞中具有启动子活性。而在HEK293细胞中,荧光素酶相对活性明显较在ARPE-19细胞中低,进一步证实了RPE细胞中RDH5基因启动子活性较高。并且,在两种细胞中,pGL3-RDH5-G荧光素酶相对活性均高于pGL3-RDH5-C,说明rs3138144位点影响RDH5基因转录活性,携带G等位基因的启动子转录活性高于C等位基因。同时在电泳迁移率变动分析中,观察到野生型G型探针及突变型C型探针均能与核蛋白中的某种转录因子结合而导致电泳迁移率发生变化,但G型探针的结合力明显较C型探针强。
本研究表明,RDH5基因内含子区SNP位点rs3138144(G>C)可以影响RDH5基因启动子转录活性。该基因对近视易感性的影响可能通过视黄酸信号通路实现,其具体作用机制尚需进一步实验研究证实。