重楼皂苷VII抑制肺癌H460细胞增殖和迁移能力研究

何 昊，钱小英，靳曼菲，王凯迪，郑 蕾，成 昭

西安医学院药学院，西安 710021

肺癌为临床最常见的恶性肿瘤疾病之一，肺癌的发病率和死亡率在绝大多数国家和地区中男性均高于女性。在中国等发展中国家，由于烟草的使用持续增加等因素，肺癌的发病率也在逐步增加[1]。研究表明，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)在肺癌中比例超过80%，且5年生存率低于15%[2]，大细胞肺癌即为其中一种。中医药在治疗肺癌方面具有较为悠久的传统，并积累了较为宝贵的临床应用经验，中药能够通过提高免疫系统功能、降低血液黏度、影响肿瘤细胞周期以及诱导肿瘤细胞凋亡等方式来抑制肺癌细胞生长，防止肺癌发生转移[3]。重楼为百合科植物云南重楼ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand-Mazz.或七叶一枝花ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara的干燥根茎[4]。主产于四川、云南、陕西等地，七叶一枝花亦为秦巴山区特色太白七药之一，为清热解毒类中药。现代药理研究发现，重楼中发挥主要药效作用的是其中的甾体皂苷类成分，即重楼皂苷。重楼皂苷VII即是其中之一，为具有偏诺皂苷元的皂苷类化合物，有研究显示其有抗肿瘤活性[5,6]。本研究以人大细胞肺癌H460细胞为研究对象，观察重楼皂苷VII作用后对细胞增殖、体外迁移、侵袭等的影响，为重楼皂苷应用于肺癌及相应的药物开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

人大细胞肺癌NCI-H460细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.1.2 药品与试剂

重楼皂苷VII购自于成都普菲德生物技术有限公司(纯度≥98%，批号：76296-75-8)；RPMI-1640培养液、胎牛血清、青霉素、链霉素(美国HyClone公司)；四甲基偶氮唑蓝噻唑蓝(MTT)、Hoechst 33258染料(美国Sigma公司)；Matrigel基质胶(美国BD公司)；Transwell小室(美国Corning公司)；MMP-2、MMP-9、caspase-3、ICAD、Bax、Bcl-2、GAPDH抗体(美国Proteintech公司)。

1.1.3 主要仪器设备

二氧化碳培养箱(美国Thermo Fisher公司，Thermo 3111)；倒置荧光显微镜(日本Nikon公司，IX73)；自动全波长酶标仪(美国Thermo Fisher公司，Multiskan GO)；分析电子天平(美国OHAUS公司，AX224ZH)；化学发光成像系统(美国Bio-Rad公司，ChemiDoc XRS+)；western blot系统(美国Bio-Rad公司，Universal)；超纯水机(美国Thermo Fisher公司，MicroPure)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及重楼皂苷VII储备液的配制

H460细胞于RPMI-1640完全培养液(10%血清和1%双抗)中贴壁生长，培养箱条件为37 ℃，5%二氧化碳，取对数生长期的细胞用于实验。重楼皂苷VII用DMSO溶解为100 mmol/L的浓度，分装保存于-20 ℃冰箱，根据实验需要用完全培养液稀释成目标浓度，并保证DMSO的终浓度低于0.05%，使其不会对研究产生显著影响。

1.2.2 重楼皂苷VII对细胞增殖能力的影响

取对数生长期H460细胞，0.25%胰蛋白酶消化，用RPMI-1640完全培养液配成单个细胞悬液，稀释至8×104个/mL，接种于96孔培养板中，每孔100 μL，放入培养箱，培养24 h。吸出旧培养液，将重楼皂苷VII用完全培养液稀释成不同浓度(0、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol/L)作用于细胞，每孔100 μL。24 h后，弃去原培养液，PBS洗涤两次，每孔加入MTT溶液(MTT∶培养液=1∶9)100 μL，37 ℃继续孵育4 h后，弃去上清液，加入150 μL DMSO溶解甲臜，选择490 nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果。按照细胞抑制率=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%，计算重楼皂苷对肺癌细胞H460抑制率及24 h的IC50。

1.2.3 细胞集落形成实验

收集对数生长期的H460细胞，调整细胞浓度至3×103个/mL，6孔板中每孔加入2 mL细胞液，培养24 h。弃去旧培养液，加入2 mL不同浓度的重楼皂苷VII(0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μmol/L)，连续培养20天。20天后除去培养液，每孔用500 μL甲醇固定15 min，PBS清洗2次，加入500 μL 0.1%结晶紫染色5 min，PBS清洗后拍照。

1.2.4 细胞划痕实验

将H460细胞悬液接种于6孔板内，待细胞贴壁生长后，在各孔细胞贴壁底部划痕，并在实验组各孔分别加入不同浓度的重楼皂苷VII(0.2、0.4、0.8 μmol/L)空白对照孔加入完全培养液。并于0、12、24、48 h在倒置显微镜下对划痕拍照，观察划痕内细胞迁移情况。

1.2.5 细胞迁移和侵袭能力

Transwell迁移实验：取对数生长期的H460细胞，消化重悬，调整浓度至2×105个/mL。Transwell小室中每孔接种200 μL细胞悬液，并在下室内每孔加入600 μL含20%血清的培养液，其中含有不同终浓度的重楼皂苷VII(0、0.1、0.2、0.4 μmol/L)，置于培养箱中。24 h后，弃去小室中培养液，PBS清洗后甲醇固定20 min，结晶紫染色3 min，棉签擦去小室内细胞，显微镜下随机5个视野观察细胞。

Transwell侵袭实验：将Matrigel胶用预冷的无血清培养液按1∶3稀释后，均匀铺于小室底部，于37 ℃培养箱中，孵育5 h，洗出小室内残余液体，后续操作同Transwell迁移实验。

1.2.6 Western blot检测蛋白表达

取对数生长期的H460细胞，接种于T25培养瓶中，24 h后，弃去旧培养液，使用含有0.4 μmol/L重楼皂苷VII的完全培养液，分别作用0、12、24、48 h后，收集细胞，裂解提取蛋白。用12%的SDS-PAGE电泳分离，之后转移至PVDF膜，用5%的脱脂牛奶封闭2 h，洗涤后，使用不同浓度的一抗分别进行孵育，过夜。次日洗涤后，使用二抗继续孵育1 h，洗涤后使用ECL发光液进行化学发光后，成像曝光条带，以GAPDH为内参进行分析。

1.2.7 统计学分析

2 结果

2.1 重楼皂苷VII抑制H460细胞生长

不同浓度的重楼皂苷VII作用于H460细胞24 h后，与空白对照组对比，重楼皂苷VII处理组的细胞存活率显著受到抑制，随着浓度增加，细胞生长抑制作用也逐渐增强，其24 h的IC50值为0.98±0.24 μmol/L(图1)。

图1 重楼皂苷VII抑制H460细胞生长(n=3)Fig.1 Polyphyllin VII decreases the viability of H460 cells (n=3)

图2 重楼皂苷VII处理H460细胞前后形态对比Fig.2 The morphology change of H460 cells after treatment of polyphyllin Ⅶ

图3 重楼皂苷VII对H460细胞集落形成的影响Fig.3 The effect of polyphyllin VII on colony formation of H460 cells注：与对照组相比，**P<0.01。Note:Compared with control group,**P<0.01.

2.2 重楼皂苷VII对H460细胞形态和集落形成的影响

重楼皂苷VII(0.8 μmol/L)处理细胞24 h，与空白组相比，采用Hoechst 33258染色观察发现，细胞存活率显著下降，且细胞形态发生了变化(图2)。此外，由图3可见，随着重楼皂苷VII浓度增大，H460细胞形成集落能力越弱，表明H460细胞集落的形成与重楼皂苷VII浓度呈负相关。

2.3 重楼皂苷VII对H460细胞迁移能力的影响

细胞划痕实验结果如图4所示，不同浓度的重楼皂苷VII处理H460细胞以后，在0、12、24、48 h进行观察，与空白对照组比较，处理组的细胞明显跨越划痕区域的速度变慢，划痕愈合速度降低，说明重楼皂苷VII体外抑制H460细胞迁移具有浓度和时间依赖性。

2.4 重楼皂苷VII对H460细胞侵袭能力的影响

细胞Transwell小室迁移实验结果显示，用不同浓度的重楼皂苷VII处理细胞24 h后，从小室上层通过聚碳酸酯膜进入下室的细胞数量随重楼皂苷VII浓度的增加而减少(图5)。侵袭实验结果同样显示，用不同浓度的重楼皂苷VII处理细胞24 h后，从小室上层透过基质胶进一步通过聚碳酸酯膜进入下室的细胞数量也随重楼皂苷VII浓度增加而减少(图6)。

2.5 重楼皂苷VII对H460细胞凋亡和迁移相关蛋白的影响

Western blot检测结果显示，随着重楼皂苷VII作用时间的增加，基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)MMP-2和MMP-9表达显著降低，提示其可能通过影响基质金属蛋白酶从而干预细胞的迁移侵袭过程(图7)。此外，凋亡相关蛋白剪切型caspase-3、Bax表达均升高，ICAD、Bcl-2表达含量降低，提示重楼皂苷VII可能诱导H460细胞发生了凋亡(图8)。

图6 重楼皂苷VII对H460细胞小室侵袭作用的影响Fig.6 Effect of polyphyllin VII on H460 cell invasion chamber assays

3 讨论

据统计，约有50%以上的抗肿瘤药物基于天然产物研究而来，多种天然来源的单体或提取成分都被证实具有抗肿瘤或诱导肿瘤细胞凋亡等作用[7,8]，因此，对于中药和天然药物开展研究，寻找具有抗肿瘤作用的单体或成分，具有十分重要的意义。重楼皂苷是提取自中药重楼的有效成分，本课题组前期研究发现其具有较好的抗肺癌作用效果，能通过抑制PI3K-Akt和NF-κB通路诱导肺癌细胞凋亡[6]。本研究进一步表明，重楼皂苷VII具有抑制肺癌细胞生长的作用，并且能够体外抑制其迁移和侵袭，还可能诱导凋亡的发生，同时，重楼皂苷VII调控细胞迁移和侵袭能力可能与其抑制基质金属蛋白酶MMPs相关。MMPs是一类细胞外基质(extracellular matrix，ECM)降解酶，在多种恶性肿瘤中均过表达，其具有促进肿瘤细胞生长、迁移、侵袭，以及促进肿瘤血管新生等作用[9]。MMP-2和MMP-9是两种主要的MMPs，同样具有降解ECM，促进肿瘤迁移侵袭的作用[10]。本研究表明，重楼皂苷VII抑制肺癌细胞迁移和侵袭的作用与其调节MMP-2和MMP-9的表达相关，同时，重楼皂苷VII还能够调节凋亡相关蛋白。CAD(caspase-activated deoxyribonuclease)是凋亡过程中使细胞核中DNA降解的一种酶，ICAD(inhibitor of CAD)则对其发挥抑制作用，在正常状态下两者均存在于胞浆中，维持细胞的正常生理活动[11]。重楼皂苷VII作用后，ICAD表达降低，从而使CAD抑制作用被减弱，发挥诱导凋亡的作用。Bcl-2家族是凋亡过程的重要参与者，其中Bax可促进凋亡的发生，Bcl-2则抑制凋亡的发生[12]。重楼皂苷VII作用后，Bcl-2表达降低，Bax表达升高，最终达到活化caspase家族蛋白并启动凋亡程序的目的。Caspase-3是最终的凋亡执行蛋白，其被活化剪切后，诱导了凋亡的发生[13]。综上所述，重楼皂苷VII能够显著抑制肺癌H460细胞的增殖、迁移、侵袭，其机制与调节MMPs家族蛋白并最终诱导凋亡相关，本研究丰富了重楼皂苷抗肿瘤研究的相关基础，为重楼皂苷的进一步研究开发提供了参考。

图7 重楼皂苷VII对基质金属蛋白酶的影响Fig.7 Effect of polyphyllin VII on MMPs

图8 重楼皂苷VII对凋亡相关蛋白的影响Fig.8 Effect of polyphyllin VII on apoptosis-associated proteins