沉默miR-221抑制裸鼠舌鳞癌移植瘤早期 改变的IVIM-DWI研究

张梦洁, 肖泽宇, 李娴, 何舒奇*

(1. 中国人民解放军联勤保障部队 第九〇四医院 口腔科, 江苏 无锡 214000； 2. 暨南大学 附属第一医院 影像中心，广东 广州 516032； 3. 暨南大学 附属第一医院 口腔医疗中心, 广东 广州 516032; 4. 暨南大学 附属口腔医学院，广东 广州 516032)

全球每年大约有2%的新发生癌症为口腔癌，且在口腔癌中舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC) 所占的比例最高,约40%左右[1].目前，尽管舌鳞癌手术、放疗和化疗有一些进展，但患者5年生存率仍只有50%左右[2].因此，进一步探讨舌鳞癌的发病机制以及潜在治疗靶点将有助于舌癌的治疗.本课题组前期实验已证实miRNA-221在舌鳞癌细胞中高表达，并具有促进舌鳞癌增殖和侵袭迁移的能力[3].该实验建立了裸鼠舌鳞癌皮下移植瘤模型，基于体素内不相干运动(intravoxel incoherent motion, IVIM)原理，采用多b值弥散加权成像(diffusion weighted imaging, DWI)扫描技术，对沉默miR-221抑制裸鼠舌鳞癌皮下移植瘤生成，进行监测与定量评估，并结合病理组织学与免疫组化结果，探讨抑制miR-221的表达对早期病理生理改变与IVIM参数的相关性.

1 材料与方法

1.1 材料

人舌鳞癌细胞株UM1购自中科院上海细胞库.4～5周龄BALB/C裸鼠12只，雌性，体质量为16～20 g，购自南方医科大学实验动物中心.实验条件负荷无特定病原体(SPF)要求所用物品均经高温灭菌消毒.

RPMI 1640购自美国sigma公司，无菌灭活小牛血清购自美国Gibco公司，胰蛋白酶冻干粉购自美国Invitrogen公司.钆贝葡胺注射液(商品名：莫迪司)购自意大利博莱科公司，质量摩尔浓度为0.1 mmol/kg(0.2 mL/kg).

1.2 方法

1.2.1 人舌鳞癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立

实验分为两组，各6只裸鼠.实验组在裸鼠腋下皮下注射慢病毒稳定低表达miR-221的UM1细胞(即anti miR-221组)，对照组在相同部位注射慢病毒空载体的UM1细胞(即miR-NC组).消化对数生长期细胞，离心、计数，用无血清RPMI 1640制成细胞悬液(5×107/mL)，按每只鼠0.2 mL接种于裸鼠右侧腋下.常规饲养，建立裸鼠舌鳞癌皮下移植瘤模型.每日观察记录裸鼠及皮下瘤灶的生长状态.

1.2.2 核磁共振影像(MRI)检查及数据后处理

实验组和对照组于接种后7、21 d，进行体素内不相干运动弥散成像，动态测量真性扩散系数(D值)、假性扩散系数(D*值)及灌注分数(f值).在21 d扫描完毕后全部处死取肿瘤组织.并将病理结果与MRI表现进行对照分析.每只裸鼠在扫描前尾静脉注射体积分数为4%水合氯醛(10 μL/g)进行麻醉.MRI检查采用美国GE公司的Signa 1.5T MR扫描仪，动物线圈，头先进，仰卧位，将移植瘤的中心定位于线圈及磁体的中心.扫描序列：常规快速自旋回波序列(fast spin echo，FSE)的T1加权像，参数：TE=17.6 ms，TR=440 ms，层厚2 mm，层间距0.2 mm，FOV=7.0 cm×4.9 cm，矩阵256×192，NEX=2.快速恢复自旋回波(fast recovery fast spin echo，FRFSE)的T2加权像，相关参数：TR=2 280 ms，TE=77.6 ms，FOV=7.0 cm×5.6 cm，矩阵256×192，NEX=2，层厚2 mm，层间距0.2 mm.IVIM-DWI检查序列：TR=4 200 ms，TE=101.7 ms，FOV=7.0 cm×5.6 cm，矩阵256×192，NEX=2，层厚2 mm，层间距0.2 mm.共13个b值，分别为0、25、50、75、100、150、200、400、600、800、1 000、1 200、1 500 s/mm2，对应的NEX分别为1、2、2、3、3、3、4、4、4、6、6、8、10，扩散梯度分别施加于x、y、z三个方向，轴位扫描.

数据处理在美国GE公司提供的ADW 4.5图像后处理工作站进行，观察常规序列T1WI、T2WI图像，根据经典双指数模型对原始图像进行分析得到D值、D*值及f值.感兴趣区(region of interest，ROI)选取IVIM-DWI序列上肿瘤最大层面及其上、下两个相邻层面，尽量避开脂肪、血管及坏死区域，测量3个层面的ROI并取平均值.IVIM-DWI的计算公式：Sb/S0=(1-f)×exp(-bD)+f×exp(-bD*)，Sb是不同b值的信号强度，S0是b值为0时的信号强度，D代表体素内真性扩散系数，D*为假性扩散系数，f是灌注分数[4].

1.2.3 病理学及CD34免疫组化分析

实验组和对照组各6只，分别在21 d处死取肿瘤组织，称质量后将标本浸于体积分数为10%福尔马林中，行HE染色和免疫组化.

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 常规MRI表现

anti miR-221组和miR-NC组在细胞接种后第7天，所有裸鼠MRI检查结果显示阳性.MRI横断位扫描显示，与周围组织相比，两组T1WI均呈等信号，T2WI均呈高信号，边界清晰(图1 a-d).

anti miR-221组和miR-NC组在细胞接种后第21天，MRI横断位扫描显示，与周围组织相比，anti miR-221组T1WI呈等信号，T2WI以高信号为主，内见少许点状更高信号区，边界清晰(图2 a-b)；miR-NC组T1WI呈等信号，T2WI呈高信号为主的混杂信号，内见大面积片状更高信号及等信号区，边界清晰(图2 c-d).T1WI 增强扫描后，两组瘤灶均呈不均匀强化，以瘤灶周缘强化明显(图2 e-f).

2.2 IVIM-DWI影像检查结果

anti miR-221实验组和miR-NC对照组各6只裸鼠，在细胞接种后第7天，实验组和对照组的D值，差异无统计学差异，P值为0.106，但第21天实验组的D值高于对照组，差异有统计学意义，P值为0.000；在细胞接种后第7天和21天，实验组的D*值均低于对照组，差异有统计学意义，P值分别为0.000、0.000；实验组的f值均低于对照组，差异有统计学意义，P值分别为0.001、0.000(图3-4).

图4 各时间点肿瘤IVIM-DWI序列相关参数伪彩图Fig.4 The colour map of IVIM-DWI parameters of each time point

2.3 病理结果

HE染色：100倍镜下，两组肿瘤细胞均排列成巢状或片状，细胞大小形态不一，边界清楚，胞浆比例增加，细胞核大而深染，核分裂象多见，符合鳞状细胞癌的结构特征.400倍镜下，可以看到与anti miR-221组相比，miR-NC组肿瘤内细胞数量减少，坏死增多，组织结构排列紊乱(图5).

CD34血管染色：anti miR-221组的阳性染色局限于血管内皮细胞的胞膜及胞质，呈点状或线状的散在分布，而miR-NC组血管数量明显增加，呈环状分布(图5).

图5 肿瘤HE染色切片镜下表现，免疫组化检测CD34的表达Fig.5 Tumor HE staining and Immunohistochemistry test of CD34 expression

3 讨论

3.1 miR-221的作用机制

Micro RNAs(miRNAs)是一类长度为18～25个核苷酸，内源性非编码的小分子RNA，进化过程中非常保守[5].miRNA调控是基因表达转录后调控的一个基本因素，在细胞增殖、凋亡、侵袭、代谢和分化等过程中发挥着重要作用[6].miR-221 在许多癌症患者的肿瘤细胞中表达上调，不断有研究报道在白血病、肝癌、胃癌、乳腺癌、宫颈癌等肿瘤[7-11]中，miR-221异常表达与肿瘤的发生发展存在着密切联系.然而miR-221在舌鳞癌中的研究并不是很深入，需要进一步对其机制进行探究.

3.2 IVIM-DWI相关参数的临床价值

DWI是目前应用最广泛的功能磁共振成像技术，最早通过单指数模型计算表观弥散系数(apparent diffusion coefficient，ADC)值来比较简单的组织内水分子的弥散程度[12].Le Bihan[13]于1985年首次提出体素内不相干运动理论(intravoxel incoherent motion, IVIM)，认为活体组织内的水分子扩散不仅包括真实的水分子扩散，还包括微循环灌注引起的假性扩散.采用多b值DWI扫描，应用双指数模型对数据进行计算，将组织水分子的扩散和微循环灌注进行分离，更加真实的反映组织内水分子的扩散状态[14].该模型计算得到的影像学指数有：D值、D*值、f值.其中D值代表活体内水分子的扩散，反映扩散的情况；D*与f值代表水分子在血管内宏观运动，反映灌注的情况[15].因此，IVIM 比DWI更能准确地反映肿瘤微观的变化，对病变的定性和鉴别诊断，评价癌症治疗的疗效等方面具有更重要的作用.

3.3 沉默miR-221后IVIM-DWI序列相关参数及其病理学变化

裸鼠皮下移植瘤模型具有可重复性，数据可以量化，成功率较高，生物学特性保持较好等优点，广泛应用于许多生物医学研究[16].本研究建立了12只人舌鳞癌裸鼠皮下移植瘤模型，生长良好，成瘤率达到100%.

实验分为两组，分别对裸鼠行T1WI、T2WI及连续动态增强扫描，可以清晰显示皮下肿瘤的位置，进而观察肿瘤的内部结构及周围情况，经尾静脉注射 MR对比剂钆贝葡胺能使肿瘤得到明显强化.第7天时，两组肿瘤边界清晰，在 T1WI上呈等信号，T2WI上呈高信号，信号尚均匀，瘤内无明显的出血和脂肪变性.第21天时，两组肿瘤边界清晰，在T1WI上呈等信号，T2WI上表现为以高信号为主的不均匀混杂信号，这一特征在对照组表现更为突出，肿瘤内部的更高信号区病理证实为坏死组织.说明舌鳞癌生长较快，内部血供不足，引起局部组织的缺血坏死，这也与病理检查结果相一致.T1WI增强扫描后，所有瘤灶周边强化明显，而内部无强化区，说明周边为供血丰富的生长活跃区.

在细胞接种后第21天，实验组的D值显著高于对照组，差异有统计学意义，说明第21天实验组细胞生长较慢，肿瘤细胞密度和活性降低.而在细胞接种后第7天 和21天，实验组的D*值、f值均显著低于对照组，说明实验组的血流灌注低于对照组.以上结果证实沉默miR-221表达后，瘤体内细胞增殖活性降低，新生血管形成受到抑制.CD34是血管内皮细胞的特异性标记物，在肿瘤新生血管的形成中起重要作用[17].CD34表达水平与肿瘤微血管生成有一定的相关性，蛋白表达水平越高，肿瘤微血管越多.CD34在实验组表达降低，说明沉默miR-221表达后，细胞的增殖减慢，微血管的形成受到抑制，这一结果与IVIM-DWI的结果相一致.

综上所述，沉默miR-221的表达能显著抑制裸鼠皮下移植瘤体的生长，IVIM-DWI相关参数可以定量检测裸鼠移植瘤的真实扩散信息和微循环灌注信息，从而间接地反映沉默miR-221后抑制肿瘤生长的疗效.进一步证实了 miR-221作为潜在的分子靶点，在舌鳞癌转移中发挥着重要的作用.