内质网自噬与内质网稳态*

王子同， 王鹏宇， 李 弘△， 杨力明

（1哈尔滨医科大学基础医学院病理生理学教研室，黑龙江哈尔滨150081；2哈尔滨医科大学大庆校区基础医学院病理生理学教研室，黑龙江大庆163319）

内质网（endoplasmic reticulum，ER）是真核细胞中最大的膜状细胞器，由跨越细胞质的连续片状或管状结构组成，参与蛋白质合成、修饰和转运，脂质和类固醇合成，Ca2+平衡及分泌的调节等[1]。ER是一种高度动态化的细胞器，其膜蛋白及脂质的半衰期约为3～5 d，需要经过不断地翻新以维持其结构和功能的完整性。除了基础的循环周转外，在Ca2+平衡失调、缺氧、生物合成需求量增大、未折叠蛋白丰度增加、蛋白超聚积或者药物作用等情况时，ER 会发生应激，其中积累的大量未折叠或错误折叠蛋白，超出ER 负荷，致使ER 扩张，此时ER 必须为适应各种应激源而更活跃地周转，以防止过度扩张，维持ER 稳态。管状ER 流动性强，不断地沿细胞骨架伸长、缩回、融合和分支；而片状ER 的流动性较差，但仍有能力在生物刺激下扩大，并在应激结束后恢复原有形态[2]。ER 膜在与过氧化物酶体、脂滴、高尔基体、线粒体等的接触处有连接复合物，这些接触可能参与调节Ca2+稳态、脂质组成、运输和信号转导等功能[3]。此外，ER 形态与细胞功能有关，一些高度分泌性细胞，如胰腺泡细胞含有丰富的片状ER，而产生类固醇激素的肾上腺细胞则有大面积的管状ER。浆细胞、成骨细胞、肝细胞、唾液腺细胞等，由于其前体细胞状态，在分化时也会出现ER扩张反应。

1 ER稳态的调节

ER 应激与多种病理变化相关，未折叠或错误折叠蛋白在ER 腔内积累可触发下游级联通路与效应机制，重塑ER 以恢复稳态[4]，其主要反应途径为未折叠蛋白反应（unfolded protein reaction，UPR）。UPR 有3 个可传感ER 应激的信号分支，分别为需肌醇酶1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）、蛋白激酶R 样ER 激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）和转录激活因子6（activating transcription factor 6，ATF6）。未折叠蛋白或错误折叠蛋白在ER 腔内积累后，会与分子伴侣免疫球蛋白结合蛋白/葡萄糖调节蛋白78（binding immunoglobulin protein/glucose-regulated protein 78，BiP/GRP78）结合，此时，BiP/GRP78从传感作用的蛋白腔内结构域脱离，并使其具有活性。其中，IRE1α 由于具有核糖核酸酶结构域，可启动X-box 结合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP1）的非常规mRNA 剪接，产生具有活性的转录因子XBP1s，入核后上调了ER 腔内分子伴侣及折叠酶和ER 相关降解（ER-associated degradation，ERAD）因子，增强ER 处理和清除未折叠蛋白的能力[5-6]。运输到高尔基体内的ATF6 被蛋白酶切割成具有转录活性的多肽，再转位到细胞核中，进而上调ER 分子伴侣，ERAD 关键成分并促进XBP1 转录[7]，与IRE1α 协同发挥作用。PERK 在急性ER 应激时激活速度较前两者慢，其蛋白激酶活性能使真核翻译起始因子2α（eukaryotic initiation factor-2α，eIF2α）在Ser51 处磷酸化，阻止蛋白翻译，进而减少新蛋白分子进入ER，减轻ER 蛋白负荷[8]；PERK 也可上调转录激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4）使C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）的转录水平升高。CHOP 可以上调生长停滞和DNA 损伤诱导蛋白34（growth arrest and DNA damage inducible 34，GADD34）水 平，而GADD34 蛋白可去磷酸化eIF2α，在应激中发挥负反馈的作用，以恢复细胞正常功能[9]。

然而，上述UPR对于ER稳态的调控并不总是有效的，若ER 应激持续存在，会导致ER 重要功能的失调，甚至会通过CHOP 或其他机制激活凋亡通路[10]。在此过程中受到影响的UPR 信号可促进病理性炎症、细胞死亡及肿瘤的发生。一些癌细胞甚至长期耐受低水平的ER 应激，而不影响本身的活性。对于ER稳态的调控一直是众多研究者聚焦的重点。

2 ER稳态与自噬

自噬是指将胞质“货物（cargo）”运送到溶酶体进行降解再利用以维持循环周转和细胞能量需求的过程，根据其向溶酶体运输的方式不同可分为3 类：巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬。自噬也可选择性地针对受损的细胞器和细胞结构进行降解，这一过程被称为选择性自噬，根据其降解底物不同，又可进一步划分为脂质体自噬、过氧化物酶体自噬、核糖体自噬、细胞核自噬、线粒体自噬和ER自噬（reticulophagy/ER-phagy）等。早期研究发现，ER 应激信号和UPR均可导致自噬作用增强[11]。在衣霉素和毒胡萝卜素诱导的IRE1 传感途径中，研究人员在人神经母细胞瘤细胞中观察到自噬体，小鼠成纤维细胞也出现微管相关蛋白1 轻链蛋白3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）脂化[12]。并且在人胶质母细胞瘤和几个腺癌细胞系中，发现低氧下游的ER 应激 通过ATF4 和CHOP 导 致LC3B和Atg5转录上调[13]。在氨基酸饥饿诱导的小鼠成纤维细胞自噬中，一系列核心自噬基因和胞质“货物”受体也被鉴定为PERK 依赖的ATF4 转录靶点[14]。需要说明的是，上述研究均未涉及自噬是否直接调控ER 稳态或参与ER 的降解，早期研究认为ER 膜是自噬体膜的主要来源，而自噬体内部的ER 膜是一般自噬中细胞质的大量吞噬所致[15]。敲除T 淋巴细胞中的Atg7等位基因或B 淋巴细胞中的Atg5等位基因完全抑制自噬功能后，可见ER 扩张和ER 应激信号升高[16-17]。在苯巴比妥处理肝细胞的ER 体积恢复过程中，检测到自噬体中含有ER，且当自噬功能被抑制时，过量的ER 形成了ER 螺旋，提示自噬功能在ER 稳态中至关重要[18]。此外，野生型酵母用UPR诱导剂处理时，超微结构分析首次表明，ER可以被选择性地封存在自噬体样空泡中[19]。直到2015 年Aliaksandr 等[20]才确定哺乳动物中ER 选择性自噬的存在。自噬介导的ER 及其内容物降解起初被认为是ERAD 途径无效时的备选途径，但ERAD 途径的底物主要是蛋白质，不包括扩张的ER，且一些错误折叠蛋白由于其自身结构不能进入ERAD 途径，而在ER 中积累，近期研究证据也表明，这些多余的ER 膜和蛋白最终被ER选择性自噬降解[18]。

3 ER的选择性自噬

ER 自噬过程中的选择性意味着需要特定的受体将待降解的ER 亚域和自噬机制联系起来。到目前为止，已鉴定出2 个酵母菌ER 自噬受体及6 个哺乳动物ER自噬的受体（表1）。这些受体至少含有一个LC3 相互作用区（LC3-interacting region，LIR）、γ-氨基丁酸受体相关蛋白（γ-aminobutyric acid receptor-associated protein，GABARAP）相 互 作 用 基 序（GABARAP-interacting motif，GIM）或ATG8 相互作用基序（ATG8-interacting motif，AIM）。有些受体还可与最上游启动自噬的复合体成分相互作用，例如，细胞周期进展基因1（cell cycle progression gene 1，CCPG1）具有200 kD 大小的黏着斑激酶家族相互作用蛋白（focal adhesion kinase family-interacting protein of 200 kD，FIP200）相互作用区（FIP200-interacting region，FIR），ATG39 具有ATG11 结合区[15]。ER自噬可分为3 种不同途径，在巨ER 自噬中，自噬体包围着ER 的片段，并与溶酶体融合，降解含有ER 的内部物质。在微ER 自噬作用中，不需要自噬体形成，溶酶体膜收缩并将ER 的一部分“掐断”到溶酶体腔内进行降解。此外，溶酶体还可以直接与ER 衍生的囊泡进行融合并降解[18]（图1）。

表1 哺乳动物和酵母菌中内质网自噬受体的结构和特点Table 1. Structure and characteristics of ER-phagy receptors in mammals and yeast

3.1 酵母菌中的ER 自噬受体ATG39 和ATG40 Sebastián 等[19]在酵母菌中首次发现ER 自噬，用于描述在UPR 中ER 螺旋被液泡选择性降解的过程。在UPR 条件下，ER 体积和膜含量增加，需通过液泡降解消除多余的膜，从而重新建立初始的ER 稳态。研究证实，典型的核心自噬机制在此过程中是非必要的，液泡也可通过微自噬途径直接吸收待降解的“货物”[21]。在营养缺乏或雷帕霉素的作用下，ER 片段可以被隔离为ATG8 阳性的自噬体，且该途径需要ER 自 噬受 体ATG39 和ATG40 通 过AIM 与ATG8 结合[22]。ATG39和ATG40并不同源，存在于ER的两个不同区域。ATG39 是一种跨膜蛋白，位于核周ER，参与调控核周ER 的降解。而ATG40 是一种膜内蛋白，主要存在于外周ER 中，对外周ER 的降解有重要作用。ATG40 还包含一个类似于哺乳动物内质网蛋白同源域（reticulon homology domain，RHD）的结构域，用于调控膜的形态，并可能促进ER 片段化[23]。此外，ATG39 还可与ATG11 相互作用，ATG11 能在受体-货物复合体处招募自噬体生物合成，进而介导自噬[22]。

3.2 哺乳动物细胞中的ER自噬受体

3.2.1 序列相似性家族134（family with sequence similarity 134，FAM134） FAM134 成员B（FAM134 member B，FAM134B）是目前研究最广泛的ER 自噬受体。FAM134B 主要定位于片状ER，含有RHD，可在磷脂双分子层外侧形成两个疏水的楔状结构，促进ER 膜弯曲，胞质面的LIR 与LC3/GABARAP 结合，发挥ER 自噬受体的作用。人骨肉瘤细胞中，FAM134B 过表达会导致ER 片段化并形成FAM134B富集的自噬体。相反，在人骨肉瘤细胞中对FAM134B的RNA 干扰或小鼠成纤维细胞中对FAM134B敲除则促进ER 扩张[20]。atlastin（ATL）是一种介导同型ER 融合的GTP 酶，其家族成员ATL2也参与了FAM134B 介导的ER 自噬过程。研究发现，在ATL2 耗竭后，FAM134B 过表达诱导的ER 自噬受到抑制，且证实ATL2 在此过程中发挥了重塑ER 膜以分离FAM134B 阳性ER 亚域的作用，从而保证ER 自噬有效地进行[24-25]。FAM134B 参与溶酶体清除ERAD 抗性的错误折叠蛋白及ER 亚域的过程，对于α-抗胰蛋白酶的突变多聚体，FAM134B 介导的清除机制涉及LC3脂化，但与自噬体生物发生机制无关，属于第3 种ER 自噬，也称为ER 到溶酶体相关降解（ER-to-lysosome-associated degradation，ERLAD）[26]。而对于原胶原，LC3 脂质化和自噬生物发生机制均参与FAM134B 介导的分解代谢过程，属于巨ER 自噬[27]。且在这两种情况中，钙连蛋白都发挥使ERAD抗性的错误折叠蛋白在ER 亚域中分隔并显示FAM134B的作用。

Figure 1. Different types of ER-phagy.图1 内质网自噬的不同类型

FAM134B突变或者表达降低可导致遗传性神经变性疾病。对C 型尼曼-匹克病患者样本分析显示ER自噬的关键成分（包括FAM134B）发生了变化[28]，致病突变体I1061T NPC1 主要通过ERAD 或FAM134B 介导的ER 自噬进行降解。FAM134B 突变还可导致常染色体隐性遗传的II 型感觉和自主神经病 变（hereditary sensory and autonomic neuropathy type II，HSAN2）[29]。FAM134B基因敲除小鼠背根神经节组织切片的超微结构可见ER 小管扩大，高尔基体囊泡变形，且离体培养的背根神经节敲除FAM134B 后发生凋亡[30]。FAM134B 参与癌症发生发展。FAM134B 在食管鳞癌中表达水平上升，且过表达FAM134B的NIH 3T3细胞注射入裸鼠中细胞生长加速并形成肉瘤[31]。在食管鳞状细胞癌患者的淋巴结转移中也检测到FAM134B 突变，表明FAM134B的突变可能促进了癌症进展[32]。此外，在侵袭前和侵袭性大肠恶性肿瘤中，也发现FAM134B基因拷贝数变化与临床和病理特征之间存在显著相关性[33]。与FAM134B 关联疾病还包括过敏性鼻炎[34]，血管疾病[35]和病毒感染。FAM134B的缺失导致小鼠胚胎成纤维细胞中传染性埃博拉病毒的增殖效率更高，核衣壳积累[36]。且FAM134B 还被证明可以同时限制登革热和寨卡病毒复制。因此有人提出，依赖FAM134B 的ER 自噬会限制病毒复制，可能成为开发新型抗病毒治疗药物的靶标[37]。

3.2.2 网状蛋白（reticulon，RTN） RTN 是管状ER中高度富集与ER 重塑相关的膜蛋白，目前发现有4种类型。每种RTN 都有大量不同的剪切体亚型，但只有最长的一个RTN3L具有ER自噬受体的功能，该蛋白的胞质面含有6 个LIR。氨基酸饥饿状态下，RTN3L 过表达可诱导含有RTN1、RTN3、RTN4 等的管状ER 片段化，并介导ER 片段向溶酶体运输的巨ER 自噬过程[38]。完全敲除RTN3L 不会影响非选择性自噬，也没有改变管状与片状ER 的比率，只降低了饥饿诱导的ER 周转，表明这两种机制可能是以独立的方式促进ER 稳态。RTN3 可与β 位淀粉样蛋白前体蛋白裂解酶1（β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1，BACE1）相互作用，而BACE1是启动阿兹海默病斑块中主要蛋白β-淀粉样肽生成的关键酶[39]。常染色体显性遗传的胰岛素基因突变所致青少年型糖尿病（mutantINS-gene-induced diabetes of the youth，MIDY）的突变体激素——秋田胰岛素原突变体的聚集体，也靠RTN3 依赖的ER 自噬所降解。但RTN3 的这种功能与LIR 无关，提示该ER 自噬可能是由与RTN3相互作用的另一种蛋白介导[40]。

3.2.3 atlastin 3（ATL3） atlastin 家族主要定位于高度弯曲的ER 膜，包括管状ER 和片状ER 的边缘。ATL3 包含GTP 酶结构域和RHD，还有两个GIM 与GABARAP 亚家族蛋白相互作用，该功能是ATL3 作为管状ER 自噬受体所必需的。在氨基酸饥饿的COS-7 细胞中，ATL3 主导巨ER 自噬，几乎检测不到RTN3L，但RTN3L 表达载体可以挽救ATL3敲除的COS-7 细胞中被影响的ER 自噬[41-42]。ATL3 突变易导致常染色体显性遗传的1F 型感觉神经病变（hereditary sensory neuropathy type 1F，HSN1F）[43]，致使ER 与线粒体之间的连接增加，影响线粒体功能和运动性[44]。在HeLa 细胞中，致病变体ATL3 Y192C 降低了管状ER 网络的复杂性，导致囊泡出芽延迟，自噬受损，并促进了高尔基体碎裂和核畸形[45]。ATL3 Y192C 及另一种突变体ATL3 P338R 均显示出与GABARAP 的结合减少，表明ER 自噬受损参与疾病的发生和发展。

3.2.4 睾丸表达基因264（testis expressed gene 264，TEX264） 在营养丰富的条件下，TEX264 多定位在ER 的三向连接，也可定位到较大的结构上并介导自噬。TEX264 是跨膜蛋白，其胞质部分有一个靠近LIR 长的弹性无序区域（intrinsically disordered region，IDR），IDR 折叠成一个不紧密的结构，可连接由于核糖体引起的ER 与自噬体膜的20 nm 间距，IDR 的长度而非其氨基酸序列是ER 自噬受体活性必 需 的[46]。通 过 敲 低 每 种ER 自 噬 受 体，比 较FAM134B、CCPG1、RTN3L 和SEC62 与TEX264 的相对效果，发现TEX264的降低最有效地抑制了饥饿条件下HeLa 细胞中的ER 自噬活性[47]。TEX264 负责了细胞中一半以上饥饿诱导的ER 自噬流，但并非所有的ER蛋白都对TEX264介导的ER自噬敏感，蛋白质组学研究也提示TEX264 可能靶向特定的ER 区域[47]。在自噬小体内的时间分辨成像显示，LC3 的募集要早于TEX264 的募集，表明与含有RHD 的受体（FAM134B 和RTN3L）不同，跨膜受体（CCPG1、SEC62 和TEX264）本身不能促进膜弯曲及片段化，可能起到的是连接ER 和自噬体膜的作用，还需要另一个信号或蛋白促进ER 出芽和片段化[48]。迄今为止，尚未发现与TEX264相关的病理变化。

3.2.5 SEC62 SEC62 是易位子复合物SEC61/SEC62/SEC63 中的成分，参与新生多肽的翻译后插入ER。SEC62 主要在急性ER 应激恢复时介导ER巨自噬和微自噬来调节ER 的周转，重建应激前ER体积和含量。生物信息学分析发现，SEC62 的LIR功能区对恢复性ER 自噬（recovER-phagy）过程必不可少，但与其蛋白转运作用联系不大[49]。事实上，恢复性ER 自噬可清除ER 片段，并保留未受损线粒体，且该代谢途径针对的是ER 应激后含有分子伴侣和折叠酶的ER 亚域，不包括如含ERAD 相关因子的其它ER 区域[50]。在前列腺癌、肺癌、头颈部鳞状细胞癌、宫颈癌及肝细胞癌中，SEC62 表达水平升高，而SEC61 和SEC63 的表达没有改变[51-52]，提示SEC62 介导ER 自噬可能使肿瘤细胞对ER 应激更具抵抗力[53]，研发阻断ER 自噬的药物可能是治疗这些肿瘤的有效方式。

3.2.6 CCPG CCPG1 是一种脊椎动物特有蛋白，在ER 应激时被诱导，激活外周ER 自噬。CCPG1 的跨膜域使其锚定在ER膜上，且胞质面含有一个LIR。作为非典型的ER 自噬受体，CCPG1 还含有两个FIR。与酵母ATG39/ATG11 相互作用的情况相似，FIR 也促进自噬的招募。在ER 应激期，内源性CCPG1 介导外周ER 自噬降解，在CCPG1基因敲除小鼠的胰腺腺泡细胞和胃主细胞中，也发现ER 扩张，特别是胰腺ER 腔内还发现大量蛋白聚集及UPR信号上调，此时小鼠仍能存活，但可能在衰老过程中对炎症信号更加敏感[54]。迄今为止，尚无关于CCPG1 与人类疾病直接相关的报道。但有学者提出，调控CCPG1功能可能用于减轻胰腺炎中的ER应激，或者可能通过增强ER应激而消除胰腺癌细胞。

FAM134B、SEC62 和ATL3 分 布 十 分 广 泛，TEX264 也在除心脏和肾脏的大多数组织器官中表达，而CCPG1 则似乎只在胰腺、肾脏和肝脏中表达。这些受体在恢复ER 稳态过程中可以是特异的，也可能发挥协同作用。首先，它们可以介导ER 不同区域的降解。FAM134B 主要介导片状ER 的降解，RTN3L 和ATL3（可能还有CCPG1）介导管状ER 的降解，而TEX264 更多与三向连接相关。其次，每个ER自噬受体可能参与不同刺激引发的ER 自噬。饥饿诱 导 的ER 自 噬 是 由FAM134B、RTN3L、ATL3 和TEX264 介导的，而CCPG1 和SEC62 分别介导ER 应激期间和从ER 应激恢复期间的ER 自噬[18]。此外，含有RHD 的受体（FAM134B、RTN3L 和ATL3）由于其部分插入但不完全穿过的ER 膜内楔状结构，可以使膜弯曲，其过表达则可促进ER 的片段化，且ATL3的GTP 酶结构域也可促进ER 出芽及最终分离，再通过LIR 依赖的自噬途径降解。相比之下，跨膜受体SEC62、CCPG1 和TEX264 不表现出内在的片段化活性，可能需要其他信号来介导ER 的分离。尽管如此，也有学者猜测该类自噬受体的积累仍有可能在面对自噬体的部位诱导分子聚集，进而导致曲率的产生和膜的分裂。

4 问题与展望

ER 蛋白可以被自噬和蛋白酶体降解，但ER 膜只能被自噬降解，这两种途径共同维持了ER 稳态，其相对贡献尚不清楚，且可能具有协同效应。许多蛋白质可通过这两种途径降解[18]，底物蛋白的拓扑结构、错误折叠位置、蛋白的修饰性如糖基化和二硫键的形成可能决定其优先降解方式。研究发现，蛋白酶体抑制剂（硼替佐米和卡菲佐米）和溶酶体抑制剂（氯喹）在联合治疗多发性骨髓瘤中表现出累加增效[55-56]。

此外，激活ER 自噬的分子途径仍然是一个重要的科学问题，目前对单个ER 自噬受体表达水平的调控知之甚少。ER 自噬受体基因的转录增加可能是启动ER 自噬的第一个触发因素，受体在其中的作用仅仅是标记待降解的ER 还是也参与了ER 亚域的分离和感应ER 应激有待进一步研究。含有RHD 的受体和跨膜受体可发挥不同作用，另外受体的腔内结构域也可能具有感知氧化还原状态、Ca2+浓度或未折叠蛋白变化的功能。UPR 可以上调CCPG1 转录，且在胰腺泡细胞中CCPG1启动子与依赖IRE1α 的肌肉、肠、胃表达因子1（muscle，intestine and stomach expression 1，MIST1）互相结合，提示ER 应激与ER自噬之间联系紧密[54]，因此分析UPR 是否也可以直接调节其他受体活性将是下一个研究焦点。

可以确定的是ER 自噬通过降解ER 膜，去除ER腔内聚集的蛋白及分子伴侣，起到了维持ER 稳态的作用。ER 自噬与某些神经退行性疾病及癌症等有关，其自噬受体可能是潜在的治疗靶点。目前，对ER 自噬的研究仍是有限的，值得注意的是，迄今发现的6 种哺乳动物自噬受体的功能在ER 自噬的一些情况下看来可能是过剩的，且很少有组织在ER 自噬受体缺失的情况下受影响，这使得ER 自噬的生理意义被严重低估了，这些受体很可能有额外的功能待深入研究，将来也可能会发现更多的ER 自噬受体。对ER 自噬在ER 乃至细胞稳态更深入的研究，揭示其在疾病发生发展过程的作用，有助于人类找到新型有效的治疗方法。