丹参素治疗妊娠期高血压大鼠效果及机制探讨

刘莎莎，孙国强，吴利荣

1 湖北省妇幼保健院，武汉430070；2 武汉科技大学附属汉阳医院

妊娠期高血压（PIH）一般发生于妊娠20 周后，以高血压、蛋白尿、水肿为主要临床症状并伴全身性多脏器损害［1-2］。PIH 病因和发病机制复杂，是导致孕妇和胎儿死亡的主要原因［3-4］。胎儿正常生长发育需要胎盘建立丰富的血管网络和滋养层细胞。在PIH 过程中，胎盘组织所分泌的生长因子水平变化对胎盘形成及胎儿发育过程起重要作用［5-6］。血管内皮生长因子受体1（sFlt-1）、胎盘生长因子（PLGF）可由胎盘分泌，是血管内皮生长因子（VEGF）家族成员，参与胎盘滋养层细胞侵袭和分化、胎盘绒毛膜血管形成及胚胎发育过程，二者表达异常与PIH 发病关系密切［7-8］。中药丹参能破宿血、生新血、安生胎、落死胎、止崩中带下，为调经脉之神品，其提取物丹参素具有降低血压、软化血管、改善血液黏度等药理作用［9-10］。近年来，多项研究发现，丹参对PIH 有较好的治疗效果［11-12］，然而具有降压和软化血管作用的丹参素对PIH 过程中PLGF、sFlt-1 表达及血管功能的影响，目前报道较少。2018 年1 月—2020 年2月，本研究观察了丹参素对大鼠PIH模型的治疗作用，并从PLGF、sFlt-1表达及血管功能方面探讨相关治疗机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料 健康雌性SPF 清洁级SD 大鼠（6～7 周龄，体质量200～220 g）购于广东省医学实验动物中心［SCXK（粤）2018-0002］，饲养于本院动物饲养中心。饲养条件：自然光照，自由饮食，温度25 ℃，相对湿度50%。本研究经本院动物伦理委员会批准，批号为IACUC-01（20160917）。实验严格遵循3R原则。丹参素注射液（规格10 mg）购自北京索莱宝科技有限公司。一氧化氮合酶（eNOs）抑制剂亚硝基左旋精氛酸甲酯（规格5 g）购自南京奥多福生物科技有限公司。HE 染色试剂盒购自上海联硕生物科技有限公司。24 h尿蛋白试剂盒购自上海联迈生物工程有限公司。一氧化氮（NO）试剂盒购自上海研生实业有限公司。sFlt-1抗体、PLGF抗体、磷酸化eNOs（p-eNOs）抗体购自美国Abcam 公司。细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒购自上海三抒生物科技有限公司。BCA 蛋白定量试剂盒和胰蛋白酶购自美国Pierce 公司。手动轮转式切片机购自德国Leica 公司。光学显微镜购自日本尼康公司。蛋白电泳仪、半干转膜仪购自美国Bio-Rad 公司。凝胶成像仪购自Miulab公司。

1.2 PIH 模型建立、分组及给药方法 参照肖丽等［12］的方法，将雌雄大鼠混养，次日检查雌性大鼠阴道精子，挑选出有精子的雌性大鼠70 只单独饲养，并记为妊娠第1 天，于妊娠第14天随机从70 只孕鼠中选出60 只经静脉注射亚硝基左旋精氛酸甲酯（7 mg/kg、1次/天、连续4 d）建立PIH模型，用小动物血压计检测大鼠尾动脉收缩压，若血压高于110 mmHg视为造模成功。将造模成功的50 只孕鼠随机分为PIH 组，丹参素低、中、高剂量组以及阳性对照组，每组10 只。妊娠第18天，丹参素低、中、高剂量组和阳性对照组分别经尾部肌肉注射5、10、20 mg/kg的丹参素和100 mg/kg 的硫酸镁［12-13］，1 次/天，共给药3 d；PIH 组只造模不给予其他药物。10只未造模的孕鼠为正常组，给予尾静脉注射生理盐水，1次/天，共3 d。

1.3 血压、尿蛋白监测 于妊娠第20 天末次给药6 h 后收集大鼠24 h 尿液，取1 mL 用考马斯亮蓝法检测24 h 尿蛋白量。于妊娠第21 天采用小动物血压测量计，借助生物信号采样分析系统，通过套尾法测定大鼠尾动脉收缩压。

1.4 胎鼠体质量、体长及畸形率、死亡率检测 各组大鼠在进行完“1.3”实验后，立即行剖宫术，小心取出胎鼠，并测定各胎鼠身长、体质量，统计畸形率、死亡率。

1.5 胎盘质量及胎盘损伤情况观察 胎盘称重后，取0.5 g 胎盘组织剪碎，用组织研磨器匀浆，离心后取上清液，置于－20 ℃冰箱中保存，剩余胎盘组织于4% 多聚甲醛中固定24 h，常规透明、浸蜡、包埋，切成厚度为5 µm 的切片。行HE 染色，显微镜下观察胎盘组织绒毛形态变化。

1.6 血清NO 及胎盘组织中sFlt-1、PLGF、p-eNOs蛋白检测 各组大鼠用3% 戊巴比妥钠麻醉，取腹主动脉血5 mL，静置、离心后取上清液，按ELISA 试剂盒说明书检测血清NO。取组织匀浆液，于4 ℃冰箱中解冻后，用蛋白提取试剂盒及BCA 试剂盒提取蛋白并检测蛋白总浓度，取50 µg 蛋白上样，进行电泳和转膜反应，加入5% 脱脂牛奶室温封闭2 h 后，加入一抗（sFlt-1、PLGF、p-eNOs 为1∶1 000，内参β-actin 为1∶2 000），室温孵育过夜后，加入HRP 羊抗兔二抗（1∶2 000），室温孵育2 h 后，采用增强化学发光法显色，用凝胶成像仪观察条带并拍照，Image J软件分析各组蛋白相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较行LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血压及尿蛋白量比较 造模各组大鼠血压、24 h 尿蛋白量均高于正常组（P均＜0.05）；PIH 组、阳性对照组及丹参素低、中、高剂量组的血压、24 h尿蛋白量依次降低（P均＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血压、24 h尿蛋白量比较（）

表1 各组大鼠血压、24 h尿蛋白量比较（）

注：与正常组相比，aP＜0.05；与PIH 组相比，bP＜0.05；与阳性对照组相比，cP＜0.05；与丹参素低剂量组相比，dP＜0.05；与丹参素中剂量组相比，eP＜0.05。

24 h尿蛋白量（mg）271.33 ± 6.71abcde 381.12 ± 16.82abcd 492.95 ± 16.99ab 498.97 ± 17.08ab 678.29 ± 18.64a 163.17 ± 16.29组别丹参素高剂量组丹参素中剂量组丹参素低剂量组阳性对照组PIH组正常组n 10 10 10 10 10 10血压（mmHg）125.92 ± 10.19abcde 140.69 ± 11.21abcd 156.62 ± 11.79ab 156.59 ± 11.21ab 179.58 ± 13.25a 102.95 ± 10.99

2.2 各组胎鼠体质量、体长及畸形率、死亡率、胎盘质量比较 造模各组大鼠胎盘质量、胎鼠体质量、体长低于正常组，畸形率、死亡率高于正常组（P均＜0.05）；PIH 组、阳性对照组、丹参素中剂量组、丹参素高剂量组大鼠胎盘质量、胎鼠体质量、体长依次增高，胎鼠畸形率、死亡率依次降低（P均＜0.05）；丹参素各组大鼠胎盘质量、胎鼠体质量、体长及畸形率、死亡率两两相比，P均＜0.05。见表2。

2.3 各组胎盘组织损伤情况比较 正常组大鼠胎盘组织形态和结构正常，未见明显损伤。与正常组相比，PIH 组大鼠胎盘组织绒毛数目减少、结构萎缩、结构不清。与PIH 组相比，丹参素低、中、高剂量组及阳性对照组大鼠胎盘组织绒毛数目减少、结构萎缩等病理损伤程度减轻。见图1。

表2 各组大鼠胎盘质量、新生鼠体质量、体长、畸形率、死亡率比较（）

表2 各组大鼠胎盘质量、新生鼠体质量、体长、畸形率、死亡率比较（）

注：与正常组相比，aP＜0.05；与PIH组相比，bP＜0.05；与阳性对照组相比，cP＜0.05；与丹参素低剂量组相比，dP＜0.05；与丹参素中剂量组相比，eP＜0.05。

死亡率（%）组别n 胎盘质量（g）新生鼠体质量（g）新生鼠体长（cm）畸形率（%）3.53 ± 0.11abcde 7.01 ± 0.10abcd 13.05 ± 0.11ab 13.61 ± 0.12ab 15.09 ± 0.13a 0丹参素高剂量组丹参素中剂量组丹参素低剂量组阳性对照组PIH组正常组10 10 10 10 10 10 3.22 ± 0.04abcde 2.61 ± 0.03abcd 1.83 ± 0.02ab 1.82 ± 0.03ab 1.08 ± 0.02a 3.95 ± 0.04 5.03 ± 0.11abcde 4.61 ± 0.10abcd 3.95 ± 0.09ab 3.91 ± 0.09ab 3.29 ± 0.08a 5.57 ± 0.11 4.33 ± 0.11abcde 3.99 ± 0.10abcd 3.45 ± 0.09ab 3.41 ± 0.09ab 3.09 ± 0.03a 4.67 ± 0.04 6.53 ± 0.11abcde 19.11 ± 0.27abcd 25.59 ± 0.28ab 26.01 ± 0.29ab 30.19 ± 0.31a 0

2.4 各组大鼠血清NO 水平及胎盘组织sFlt-1、PLGF、eNOS 蛋白表达比较 造模各组大鼠血清NO水平、胎盘组织PLGF 和p-eNOS 蛋白表达低于正常组，sFlt-1蛋白表达高于正常组（P均＜0.05）；PIH组、阳性对照组、丹参素中剂量组、丹参素高剂量组大鼠血清NO 水平、胎盘组织PLGF 和p-eNOS 蛋白表达依次升高，sFlt-1 蛋白表达依次降低（P均＜0.05）；丹参素各组NO 水平及sFlt-1、PLGF、eNOS 蛋白表达两两相比，P均＜0.05。见表3、图2。

3 讨论

PIH 主要发生在妊娠中晚期，主要临床症状为高血压、蛋白尿，可导致死胎、死产、胎盘早剥及母儿死亡等严重产科并发症［14］。静脉注射亚硝基左旋精氛酸甲酯可建立大鼠PIH 模型，该造模方法简单、成功率高、大鼠死亡率低［15］。本研究用上述方法建立PIH 模型后发现，大鼠血压、尿蛋白量升高的同时，胎鼠体质量、身长降低，死胎率、胎鼠畸形率升高，伴随着胎盘质量降低及胎盘组织绒毛数目减少、结构萎缩、结构不清等病理损伤加重，与人PIH 临床症状及并发症相似，表明造模成功。

图1 各组大鼠胎盘组织HE染色观察结果

表3 各组大鼠血清NO水平及胎盘组织中sFlt-1、PLGF、p-eNOS蛋白表达比较（）

表3 各组大鼠血清NO水平及胎盘组织中sFlt-1、PLGF、p-eNOS蛋白表达比较（）

注：与正常组相比，aP＜0.05；与PIH组相比，bP＜0.05；与阳性对照组相比，cP＜0.05；与丹参素低剂量组相比，dP＜0.05；与丹参素中剂量组相比，eP＜0.05。

p-eNOS 0.94 ± 0.12abcde 0.75 ± 0.14abcd 0.56 ± 0.12abc 0.51 ± 0.13ab 0.25 ± 0.14a 1.24 ± 0.12组别丹参素高剂量组丹参素中剂量组丹参素低剂量组阳性对照组PIH组正常组n 10 10 10 10 10 10 NO（µmol/mL）30.39 ± 2.79abcde 22.42 ± 2.82abcd 14.68 ± 1.92ab 14.38 ± 1.33ab 6.92 ± 0.96a 30.86 ± 3.09 sFlt-1 0.54 ± 0.13abcde 0.73 ± 0.14abcd 1.01 ± 0.15ab 1.02 ± 0.16ab 1.41 ± 0.17a 0.24 ± 0.13 PLGF 1.06 ± 0.12abcde 0.74 ± 0.10abcd 0.47 ± 0.05abc 0.49 ± 0.06ab 0.16 ± 0.05a 1.39 ± 0.15

图2 大鼠胎盘组织中sFlt-1、PLGF、p-eNOS蛋白表达情况

近年来研究发现，血管内皮受损、血管活性物质失衡导致的血管功能紊乱是PIH 发病的重要因素［16］。eNOs 及NO 在妊娠血管内皮分化、修复及血管新生中扮演重要角色。刘怀昌等［17］发现妊娠时胎盘血管内皮细胞中eNOs增多，在促进滋养细胞分化及增殖的同时，能促进内皮细胞释放合成大量NO来扩张血管，调节血流速度来降低血压，维持孕妇循环系统功能正常，从而使孕妇更好适应妊娠全过程。这表明eNOs、NO 在妊娠血压及孕妇血液循环系统功能调节中扮演重要角色。另外，NO减少也与PIH 及不良妊娠结局关系密切。周瑞霞等［18］发现，血清NO 越高，血管内皮素水平越低，PIH 不良妊娠结局发生率越小。本研究发现，PIH 组大鼠血压升高的同时，血清NO 水平及胎盘组织p-eNOs 表达也随之降低，提示PIH 大鼠胎盘组织eNOs 活性降低，NO合成减少可能与胎盘血管功能受损关系密切。

大量研究证实，胎盘组织PLGF、sFlt-1表达异常也可引起血管生成及功能障碍，导致胎盘缺氧，参与PIH不良妊娠结局的发生［7］。JIANG等［19］发现，sFlt-1在胎盘产生后，可抑制VEGF 信号传递及生物学活性，引起血管生成障碍，并干扰胎盘滋养层细胞侵袭和分化，引起不良妊娠结局。王芳［20］研究认为，PIH过程中胎盘组织sFlt-1 异常升高引起血管生成失衡，是造成胎盘滋养层侵袭不足、子宫螺旋动脉重铸不良、胎盘缺氧的重要原因，而胎盘缺氧损伤又可进一步促进sFlt-1 生成，引起血管生成失衡及胎盘损伤，从而加重PIH 进程。PLGF 是胎盘滋养层细胞分化及内皮细胞增殖过程中的重要因子。KIDRON等［21］研究表明，PLGF能促进早孕时滋养细胞增殖与分化，诱导内皮细胞增殖、迁移并抑制内皮细胞凋亡，增加血管通透性，是重要的促血管生成因子，本研究发现，PIH 大鼠胎盘绒毛细胞数目减少的同时，也伴随着sFlt-1 表达增高及PLGF 表达减少，提示这两种变化也可能与PIH 大鼠胎盘组织损伤关系密切。

目前，临床治疗PIH 的主要药物为硫酸镁，但该药不良反应重，因此，寻找治疗PIH 安全、有效的药物是临床研究重点［22］。中医药治疗PIH 具有降压效果好、不良反应轻等优点［23］。有学者发现，中药丹参注射液在降低PIH 患者及模型大鼠血压、改善母婴结局方面有一定疗效，提示丹参可能是治疗PIH 的潜在药物，但其具体治疗机制不甚清楚［12-13］。丹参素为丹参的主要活性物质，临床研究发现其在降血压和改善微循环方面有较好疗效［9-10］。基于此，本研究推测丹参素可能是治疗PIH 的主要活性物质，并建立PIH 大鼠模型进行验证，结果发现，丹参素低、中、高剂量组及阳性对照组大鼠胎盘组织sFlt-1 表达降低，NO、PLGF、eNOs表达升高的同时，血压及尿蛋白含量也降低，胎鼠死亡率、畸形率等不良妊娠结局发生率及胎盘结构损伤等均得到显著改善，且随着丹参素剂量升高则效果越明显。另外，丹参素低剂量组改善效果优于阳性对照组，表明丹参素可减轻PIH 大鼠胎盘损伤、减少不良妊娠结局，对PIH 有较好的治疗效果，其治疗作用可能与抑制胎盘组织sFlt-1 表达、上调PLGF 表达，提高胎盘组织eNOs 活性和血清NO合成，改善胎盘血管功能有关。

综上所述，丹参素可抑制胎盘组织sFlt-1 表达、上调PLGF表达，提高胎盘组织eNOs活性和血清NO合成，减轻PIH 大鼠胎盘血管功能受损，进而改善妊娠结局，以上结果可为临床治疗PIH 提供一定参考。然而，PIH 病理过程相当复杂，丹参素还可能通过其他途径治疗PIH，且丹参素改善PIH 血管功能的具体分子机制仍需进一步探索。