二甲双胍通过调控细胞自噬对糖尿病大鼠血管内皮凋亡的影响

王卓怡，蔡建红，张月婵，支遥

(张家港市中医医院药剂科，江苏 张家港 215600)

糖尿病是危害人类健康最常见、最主要的慢性代谢病之一。以往研究显示，全球糖尿病在成人中的发病率为8.8%，患者人数达4.15亿[1]。其中，中国糖尿病的患病人数为1.1亿，居全球首位[1]。第六次全国糖尿病流行病学调查显示，中国成人糖尿病患病率高达11.6%[1]。

二甲双胍(metformin，MET)是一种经典的降糖药物。研究证实，MET可以减少糖尿病诱发的多种心血管疾病[2-4]。但是MET对糖尿病血管损伤的保护作用机制尚不清楚。自噬是一把“双刃剑”，在生物体的生理和病理学过程中发挥重要作用[5]。微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62和Beclin-1被认为是自噬的标志物[6]。既往研究证实，高糖处理人脐静脉内皮细胞48 h可以上调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，下调p62，进而导致人脐静脉内皮细胞功能障碍[7]。另外，在高糖诱导的血管内皮细胞凋亡中，激活自噬能够抑制细胞凋亡的发生，表明自噬和凋亡可能存在某种相互调节的关系。细胞凋亡在糖尿病血管损伤中起重要作用，参与糖尿病血管内皮损伤的病理过程。研究显示，高糖可以上调Bax，下调Bcl-2表达，诱导内皮细胞凋亡，进而导致糖尿病血管内皮损伤[8]。但目前细胞自噬与内皮细胞凋亡的关系尚不完全明确。本研究通过构建糖尿病大鼠模型，旨在探讨MET对糖尿病大鼠血管内皮损伤的影响及其分子调控机制。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物 选取SPF级雄性SD大鼠45只，体重180～220 g，由成都达硕生物科技有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(川)2019-0001，实验动物使用许可证号：SYXK(川)2019-015，适应性饲养1周，饲养期间给予自由饮水和饮食，光照白昼各12 h。

1.1.2实验试剂 Bax抗体(批号：14796)、Bcl-2抗体(批号：15071)、LC3抗体(批号：19848)、p62抗体(批号：7814)、Beclin-1抗体(批号：54101)购自美国Cell Signaling Technology公司；β-actin抗体购自武汉博士德公司(批号：3697)；辣根过氧化物酶标记兔二抗(批号：A0277)、辣根过氧化物酶标记鼠二抗(批号：A0286)、一抗稀释液(批号：P0256)、二抗稀释液(批号：P0258)购自上海碧云天生物技术有限公司。实验所需培养基和耗材购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.1.3主要仪器和设备 组织匀浆仪(武汉维塞尔生物科技有限公司生产，型号：ZW800G)；-80 ℃超低温冰箱(青岛海尔集团生产，型号：YY-JJ2)；4 ℃冰箱(合肥美菱股份有限公司生产，型号：ULT-25NE)；高速台式冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器有限公司生产，型号：Allegra X-15R)；荧光倒置显微镜(日本Olympus光学工业株式会社生产，型号：TC-XDS-500C)；电镜(北京京科瑞达科技有限公司生产，型号：NE910)；免疫印迹检测装置(美国Bio-Rad伯乐公司生产，型号：DYCZ-40D)；高纯水机(美国Millipore公司生产，型号：HAD-Green-30T)。

1.2实验方法

1.2.1糖尿病大鼠分组与动物模型构建 将实验动物采用随机数字法分成正常对照组、糖尿病组、MET药物处理组，每组15只。糖尿病组和MET药物处理组大鼠腹腔内注射链脲佐菌素(30 mg/kg)，对照组大鼠注射等量的0.9% NaCl注射液。链脲佐菌素注射完成后采用血糖仪检测大鼠血糖值，血糖值高于16.7 mmol/L可视为造模成功。造模成功后，MET药物处理组大鼠给予40 mg/kg的MET，每日1次；糖尿病组大鼠灌服等剂量的0.9% NaCl注射液，两组大鼠均持续灌胃8周，对照组大鼠持续喂养8周。检测三组大鼠禁食12 h后的体重、血糖和胰岛素水平。待给药时间到达进行大鼠主动脉血管组织取材，备用。

1.2.2苏木精-伊红染色 ①固定：将取得的大鼠主动脉血管组织标本放置于4%的多聚甲醛内进行固定，时长约30 min；②脱水：将血管组织分别放置于70%、80%、90%、95%、100%不同浓度的乙醇进行梯度脱水；③透明：采用二甲苯将血管组织标本透明2次；④浸蜡：将透明标本组织放置在溶化好的石蜡里，置于溶蜡箱在65 ℃下保温2 h；⑤包埋：观察石蜡完全浸入到组织中后进行包埋，待其冷却凝固为蜡块；⑥切片：标本组织蜡块用切片机在其中部自动横行切取3张4 μm厚的薄片；⑦在脱蜡和水洗后，采用苏木精进行染色，保持3 min，继续水洗之后蓝化，保持10 min，使用1%的盐酸乙醇进行分化，保持20 s，最后伊红染色，保持5 min；⑧封片：使用70%、80%、90%、95%、100%的乙醇依次进行脱水，各自保持3 min，使用二甲苯进行透明，保持5 min，最后使用中性树脂胶完成封片。观察三组大鼠主动脉形态变化。

1.2.3蛋白质免疫印迹 ①取出大鼠的主动脉血管，剪碎后放置于1.5 mL的组织研磨管内，并按照1∶2比例加入组织裂解液放置在已经预冷后的组织匀浆仪中进行研磨；②高速离心机4 ℃ 12 000×g离心15 min，收集血管组织上清液，采用二喹啉甲酸法进行血管组织凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax)和自噬相关蛋白(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62)浓度定量测定；③按照每孔上样量为40 μg进行蛋白质凝胶电泳实验，根据目的蛋白分子量大小以及蛋白marker指示进行切胶，湿转转膜操作，并采用封闭液封闭1～2 h，孵育对应一抗(1∶1 000)4 ℃过夜，孵育二抗(1∶5 000)1 h，于摇床摇晃洗膜，吐温-20磷酸盐缓冲溶液洗膜2～3次，每次5 min，滴加显影液显影并拍照。

1.2.4自噬小体检测 血管组织包埋、切片，厚度5 μL，经醋酸双氧铀和柠檬铅染色，透射电子显微镜观察血管形态以及自噬小体并对其拍照。

2 结 果

2.1三组大鼠体重、血糖、胰岛素水平比较 三组大鼠的体重、血糖、胰岛素水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，糖尿病组、MET药物处理组大鼠的体重、胰岛素水平均降低，但MET药物处理组高于糖尿病组(P<0.05)；血糖升高，但MET药物处理组低于糖尿病组(P<0.01)，见表1。苏木精-伊红染色显示，糖尿病组大鼠的血管内膜排列紊乱、内皮粗糙、中膜增厚；MET药物处理组大鼠血管内皮光滑且排列整体，见图1。

表1 三组大鼠体重、血糖、胰岛素水平比较

图1 各组大鼠主动脉血管形态变化(苏木精-伊红染色，×400)

2.2三组大鼠Bax和Bcl-2蛋白表达的比较 三组大鼠的Bax、Bcl-2蛋白表达水平比较差异有统计学意义(P<0.05)，与对照组比较，糖尿病组、MET药物处理组大鼠的Bax蛋白表达水平均升高，但MET药物处理组低于糖尿病组(P<0.05)；Bcl-2蛋白表达水平降低，但MET药物处理组高于糖尿病组(P<0.05)。见图2、表2。

2a：Bax蛋白表达变化；2b：Bcl-2蛋白表达变化

2.3MET对糖尿病血管内皮自噬小体的影响 与对照组比较，糖尿病组和MET药物处理组血管内皮自噬小体数量均明显减少，但MET药物处理组多于糖尿病组。见图3。

图3 各组大鼠电镜检测血管内皮自噬小体数量(×10 000)

2.4三组大鼠LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62蛋白表达的比较 三组大鼠LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62蛋白表达比较

表2 三组大鼠Bax和Bcl-2蛋白表达的比较

差异有统计学意义(P<0.05)，与对照组比较，糖尿病组和MET药物处理组大鼠的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平显著降低，但MET药物处理组高于糖尿病组(P<0.05)；p62蛋白表达水平升高，但MET药物处理组低于糖尿病组(P<0.05)。见表3、图4。

LC3：微管相关蛋白1轻链3；MET：二甲双胍4a：LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达变化；4b：p62蛋白表达变化

表3 三组大鼠LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62蛋白表达的比较

3 讨 论

糖尿病血管病变包括大血管和微血管病变，是诱发糖尿病患者致死、致残的主要原因[9]。血管内皮功能异常是导致糖尿病血管病变的重要因素[10]。近年来随着糖尿病患者数量急剧增加，糖尿病血管并发症的发病率亦快速上升。因此，深入研究糖尿病血管内皮损伤的分子机制、寻求有效的靶向药物防治策略已成为医学界的研究热点。

MET是一种经典的口服降糖药物，具有减少糖尿病诱发心血管疾病发生、保护心血管系统的作用。既往研究证实，MET具有抗炎、降低血压、降血脂、改善胰岛素抵抗、抑制动脉粥样硬化等作用[11-12]。但目前有关MET对糖尿病诱导的血管内皮损伤的具体分子机制尚不清楚。细胞凋亡是一种主动的程序性细胞死亡方式，是糖尿病血管内皮损伤的重要原因。本研究结果显示，与对照组比较，糖尿病组大鼠的血糖升高、体重和血浆胰岛素水平显著降低，表明糖尿病大鼠造模成功；而MET药物处理组大鼠的体重、胰岛素水平高于糖尿病组，血糖低于糖尿病组，表明MET对糖尿病具有一定的治疗效果。血管内皮细胞凋亡是内皮损伤的重要因素，其中Bax和Bcl-2是细胞凋亡的两个关键性蛋白。本研究中，与对照组比较，糖尿病组和MET药物处理组大鼠的Bax蛋白表达均显著上调，Bcl-2蛋白表达均显著下调，但MET药物处理组的Bax蛋白表达水平低于糖尿病组，Bcl-2蛋白表达水平高于糖尿病组，表明MET能够抑制高血糖诱导的主动脉血管内皮Bax表达上调，Bcl-2表达下调，改善血管内皮功能。提示MET可通过调控Bax和Bcl-2蛋白表达，抑制血管内皮凋亡，改善糖尿病血管内皮损伤。以往研究证实，MET能够通过下调胱天蛋白酶3、Bax，上调Bcl-2而抑制糖尿病心肌病和糖尿病肾病大鼠心肌细胞和肾小管上皮细胞凋亡[13-14]。但是有关MET对糖尿尿病血管内皮细胞凋亡的调控机制尚不完全清楚。

细胞自噬是一种新的调控细胞死亡的方式，按照分子机制可分为巨自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬。研究表明，自噬与糖尿病心血管病变的发生、发展有关[5，15]。但是不同的诱因和刺激强度会激活不同类型细胞自噬性的保护或损伤作用。高糖(25 mmol/L)处理心肌微血管内皮细胞可抑制细胞自噬水平，诱导心肌微血管内皮细胞凋亡[16]。在高糖(33 mmol/L)处理脐静脉内皮细胞24、48 h后，免疫印迹检测显示内皮细胞的Bax表达增加，自噬水平降低；而通过诱导自噬可以降低Bax表达，缓解高糖诱导人脐静脉内皮细胞凋亡[17]。相反，在高糖处理的心肌细胞H9c2中培养细胞48 h后，细胞自噬水平升高，凋亡增加，而通过抑制自噬可减少H9c2细胞的凋亡[13]。上述研究提示，自噬不仅可维持血管内环境稳态，还可参与血管内各种细胞生长和死亡的调控。因此，深入探讨自噬对血管内皮细胞的作用及调节机制意义重大。研究发现，在C57BL/6小鼠大脑中动脉阻塞模型中，MET预处理能够促进自噬形成，改善神经损伤[18]；在2型糖尿病肾病大鼠模型中，MET通过诱导细胞自噬，改善糖尿病大鼠肾脏损伤[19-20]。这表明，MET可通过促进自噬发挥多种诱因导致的心脑血管损伤[21]。本研究结果显示，与对照组比较，糖尿病组和MET药物处理组大鼠的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平显著降低，但MET药物处理组高于糖尿病组；p62蛋白表达水平升高，但MET药物处理组低于糖尿病组，表明MET可以诱导细胞自噬，改善血管内皮损伤。李冰玉等[22]研究表明，MET能够调控转化生长因子-β1诱导的血管内皮细胞自噬，从而发挥血管保护作用。另外，MET也可以通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号，诱导细胞自噬，从而促进垂体泌乳素瘤细胞凋亡[23]。本研究结果与上述研究结果一致。

综上所述，MET可降低糖尿病血管内皮损伤，其机制可能通过诱导内皮细胞自噬进而抑制血管内皮细胞凋亡。以上研究结果初步揭示了MET对糖尿病大鼠血管内皮损伤的保护作用机制，为MET用于治疗糖尿病血管病变提供了新的可能。