葡萄灰葡萄孢生长及产孢条件研究

李廷刚，陈广霞，张倩倩，巩东营

（1. 山东省葡萄研究院，山东济南 250100；2. 山东省农业科学院农产品研究所，山东济南 250100）

灰葡萄孢（Botrytis cinerea）属于半知菌类（Fungi imperfecti），丝孢纲（Hyphomycetes），丝孢目（Moniliales），淡色孢科（Moniliaceae），葡萄孢属（Botrytis）[1]，其侵染寄主后可引起灰霉病。灰葡萄孢寄主范围十分广泛，几乎所有的双子叶植物，包括作物、水果、蔬菜和花卉等都可侵染。此外，灰葡萄孢可侵染寄主花、果、叶、茎等多个地上组织，造成寄主多处同时发病，因此防治极为困难。灰霉病为一种世界性病害，在我国多个省份危害严重，重病区损失可达到40%～50%，甚至绝产[2-3]。

由于葡萄中抗灰霉病种质资源匮乏，加之灰葡萄孢繁殖速率快、变异频率高、适应性强，目前葡萄灰霉病的防治依然艰巨[4]。葡萄灰霉病是一种典型的气传病害，可随空气、水流以及农事作业传播，分生孢子在病害侵染循环和流行中起着关键性的作用。短期内能否产生大量的分生孢子是灰霉病能否流行的重要因素之一[5]，如何有效抑制灰葡萄孢分生孢子的形成将成为灰霉病防治的有效途径。因此，对灰葡萄孢生长和分生孢子产生条件进行系统的研究，可为葡萄灰霉病的防治提供依据。

以葡萄灰葡萄孢SYT3-7菌株为研究材料，探索不同培养基、温度、光照等对菌丝生长和产孢量的影响。旨在优化葡萄灰葡萄孢的生长和产孢条件，为开展葡萄灰葡萄孢遗传转化等需要大量分生孢子的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

山东省烟台地区葡萄园中采集有典型症状的病果，按照董娟华等[5]方法进行菌株分离，获得单孢SYT3-7。经过形态学鉴定和5.8S rDNA-ITS区序列分析，确定其为灰葡萄孢[7-8]，并保存于山东省葡萄研究院。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基对病原菌菌丝生长及产孢量的影响

选择8种真菌常用培养基（配方见表1）。取培养3 d的菌落，用打孔器沿菌落边缘取直径5 mm菌饼，移入培养基平板中央，每皿1块，于23 ℃下黑暗培养，每个处理3皿，重复3次[9-11]。采用十字交叉法测量菌落直径，每12 h测量1次，并观察菌落生长状况。静置培养7 d后，用10 mL无菌蒸馏水从培养皿上洗脱分生孢子，用血球计数法测量分生孢子产生浓度[12]（下同）。

1.2.2 温度对病原菌菌丝生长及产孢量的影响

取菌饼接入PDA和MSM平板中央，分别置于5、10、15、20、23、25、28、30、35 ℃的温度条件下黑暗培养，每个处理接3个皿，重复3次，其中PDA培养基用于灰葡萄孢生长速率的测定，MSM培养基用于灰葡萄孢产孢量的测定。

1.2.3 pH对病原菌菌丝生长及产孢量的影响

用0.1 mo1/L的NaOH或HCl将PDA培养基和MSM培养基pH值分别调节到3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0九个梯度后高压蒸汽灭菌。取菌饼分别接入PDA培养基和MSM培养基平板中央，23 ℃下黑暗培养，每个处理接3个皿，重复3次。其中PDA培养基用于灰葡萄孢生长速率的测定，MSM培养基用于灰葡萄孢产孢量的测定。

表1 8种培养基成分组成Table 1 Composition of 8 kinds of culture medium

1.2.4 光照条件对病原菌菌丝生长及产孢量的影响

取菌饼接入PDA和MSM培养基平板中央，每种培养基分为8组，于23 ℃下分别置于：持续黑暗、持续光照、12 h光照/12 h黑暗、自然光，培养12 h后置于紫外线环境照射2 h后持续黑暗、持续光照、12 h光照/12 h黑暗、自然光8种光照条件下进行培养。每个处理接3个皿，重复3次，其中PDA培养基用于灰葡萄孢生长速率的测定，MSM培养基用于灰葡萄孢产孢量的测定。

1.2.5 碳源对病原菌菌丝生长及产孢量的影响

所用基本培养基为CZA培养基，配方见表1。分别以相同质量碳素的麦芽糖、乳糖、果糖、可溶性淀粉、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、半乳糖代替基本培养基中的蔗糖，配成不同碳源的培养基，并以不加碳素的基本培养基作为对照。取菌饼接入各培养基平板中央，23 ℃下黑暗培养，每个处理接3个皿，重复3次，测量菌落直径和产孢量。

1.2.6 氮源对病原菌菌丝生长及产孢量的影响

所用基本培养基为CZA培养基，配方见表1。分别以相同质量氮素的硝酸钾、硫酸铵、硝酸铵、尿素、蛋白胨、苯丙氨酸、精氨酸、甘氨酸替代基本培养基中的硝酸钠，配成不同氮源的培养基，并以不加氮素的基本培养基作为对照。取菌饼接入各培养基平板中央，23 ℃下黑暗培养，每个处理接3个皿，重复3次，测量菌落直径和产孢量。

1.2.7 病原菌菌丝及分生孢子致死温度和时间测定

取无菌试管36支，每6支一组，向每支中加入适量无菌水，并投入6块直径5 mm的菌饼。然后将每组试管对应置于35、40、45 、50、55、60 ℃恒温水浴锅中，分别处理5、10、15、20、25、30 min，水浴锅水面要高于无菌水液面。取出试管后迅速冷却至室温，将菌饼取出接种在PDA培养基平板中央，每皿接一块，每处理重复6皿，23 ℃恒温培养48 h，观察菌丝生长情况。

取无菌试管36支，6支一组，将孢子悬浮液稀释至一定浓度后加入试管中，将每组试管分别置于35、40、45、50、55、60 ℃恒温水浴锅中，分别处理5、10、15、20、25、30 min，水浴锅水面要高于孢子悬浮液。取出试管迅速冷却至室温，各吸取1滴孢子悬液于载玻片上，每处理重复6次，23 ℃恒温培养12 h，观察分生孢子的萌发情况。

1.3 数据分析

采用微软Excel 2016和SPSS Statistics 25.0数据处理软件对所得数据进行整理和分析。

2 结果与分析

2.1 培养基对灰葡萄孢菌丝生长及产孢量影响

结果显示，灰葡萄孢在PDA培养基上生长速率最快，其次为PSA和MSM培养基，而在ATCC培养基上生长最为缓慢，仅为0.88 cm/d（表2）。7 d后对产孢量的统计结果显示，在MSM培养基上产孢最多，达到57.00×105cfu/mL，与其他培养基存在显著差异（表2）。由此可见，PDA培养基较为适合该病原菌的生长，MSM培养基适合病原菌产孢。因此，在后续试验中对于灰葡萄孢生长速率的测定采用PDA培养基，对产孢量的测定在MSM培养基中进行。

2.2 温度对灰葡萄孢菌丝生长及产孢量的影响

不同温度对灰葡萄孢菌丝生长及产孢量统计结果（表3）显示，PDA培养基上灰葡萄孢在35 ℃以上不能生长，菌丝生长的温度范围是5～30 ℃，最适温度25 ℃；分生孢子产生的适宜温度范围也为5～30 ℃，最适温度23 ℃。

2.3 培养基pH对灰葡萄孢菌丝生长及产孢量的影响

培养基不同pH对灰葡萄孢菌丝生长及产孢量统计结果（表4）显示，灰葡萄孢能适应较宽的pH范围，在pH 3～11的范围内均可以生长和产孢。最适宜菌丝生长和分生孢子产生的酸碱度均是pH6；pH5与pH6处理的菌丝生长速率差异不显著，说明灰葡萄孢在偏酸性条件下生长活性较好。

表2 培养基对灰葡萄孢菌丝生长及产孢量统计Table 2 Statistics on the hyphae growth and conidia production of Botrytis cinerea in different media

2.4 光照条件对灰葡萄孢菌丝生长及产孢量的影响

不同光照条件对灰葡萄孢菌丝生长及产孢量统计结果（表5）显示，各光照条件对葡萄灰葡萄孢生长速率影响不大，在0.01水平上差异不显著，其中以在自然光条件下生长速率最快。然而，多种光照组合条件下，灰葡萄孢的产孢量却存在一定差异，其中以紫外处理后自然光照培养下产孢量最多。

2.5 碳源对灰葡萄孢菌丝生长及产孢量的影响

不同碳源对灰葡萄孢菌丝生长及产孢量统计结果（表6）显示，灰葡萄孢在供试的8种碳源环境下均可生长，但在以葡萄糖为碳源的菌丝生长最快，在以山梨醇为碳源条件下生长最为缓慢。但产孢却以乳糖为最优碳源。在以山梨醇和甘露醇为碳源的菌丝虽然可以生长但并不产生分生孢子。另外，碳源缺乏环境下菌丝几乎不生长，也几乎不产生分生孢子。

2.6 氮源对灰葡萄孢菌丝生长及产孢量的影响

不同氮源对灰葡萄孢菌丝生长及产孢量统计结果（表7）显示，灰葡萄孢在8种氮源环境下均可生长。在以蛋白胨为氮源时不仅菌丝生长最快，产孢量也最大。在以尿素和甘氨酸为氮源的条件下生长较为缓慢，甚至低于不含氮源的培养条件。在产孢量方面，以 (NH4)2SO4为氮源时产孢量最少，但仍高于不含氮源的条件。

表3 温度对灰葡萄孢菌丝生长及产孢量统计Table 3 Statistics on the hyphae growth and conidia production of Botrytis cinerea under different temperatures

表4 培养基pH对灰葡萄孢菌丝生长及产孢量统计Table 4 Statistics on the hyphae growth and conidia production of Botrytis cinerea under different pH

表 5 光照条件对灰葡萄孢菌丝生长及产孢量统计Table 5 Statistics on the hyphae growth and conidia production of Botrytis cinerea in different light conditions

表 6 碳源对灰葡萄孢菌丝生长及产孢量统计Table 6 Statistics on the hyphae growth and conidia production of Botrytis cinerea in different carbon sources

2.7 灰葡萄孢菌丝及分生孢子致死温度和时间测定

将灰葡萄孢分生孢子在45 ℃水浴中处理30 min、50 ℃水浴中10 min之后，以及在55、60 ℃的水浴中，分生孢子均不能萌发，表明灰葡萄孢分生孢子的致死温度和处理时间为45 ℃、30 min或50 ℃、10 min。将灰葡萄孢菌丝在经50 ℃处理时间25 min、55 ℃处理时间10 min以及60 ℃处理时间5 min以上的条件下菌丝均不能再继续生长，表明灰葡萄孢菌丝的致死温度和时间分别为50 ℃处理25 min或55 ℃处理10 min（表8）。

3 讨论与结论

试验结果表明，葡萄灰葡萄孢菌丝最佳生长条件为：PDA培养基、pH6、25 ℃、自然光照下培养，碳源以葡萄糖为最佳，氮源以蛋白胨为最佳。该结果与任亚峰[8]一致，与白晓蒙等[13]的研究结果基本一致。任亚峰[8]认为，贵州地区葡萄灰葡萄孢菌丝生长的最佳碳源为葡萄糖，而白晓蒙认为菌丝生长的最佳碳源为蔗糖。本研究葡萄灰葡萄孢最佳产孢条件为：MSM培养基、pH6、23 ℃、经紫外照射后自然光培养，碳源以乳糖为最佳，氮源以蛋白胨为最佳。该结果与崔志峰等[14]的结果在pH、温度、碳氮源等方面基本一致。病原菌菌丝的致死温度为50 ℃处理25 min或55 ℃处理10 min；而分生孢子的致死温度则为45 ℃处理30 min或50 ℃处理10 min，说明灰葡萄孢菌丝对高温的耐受力明显高于分生孢子，这或许是因为在不良环境条件下，菌丝中个别细胞膨大可形成细胞厚增壁、原生质浓缩的厚垣孢子，从而抵御不良环境条件[12]。

研究还发现，在对培养基进行筛选时菌丝生长以PDA培养基为宜而产孢却以MSM培养基最佳，且与PDA培养基存在显著差异，推测葡萄灰葡萄孢分生孢子的产生存在一定的物种特异性，需要有特异性的诱导物质存在。目前，在葡萄灰葡萄孢研究中还未见系统报道，但与段亚冰等[15]对Pilidium concavum的研究结果相一致。另外，经比较分析还发现，相同的光照条件经紫外照射后，生长速率普遍低于未经紫外照射的菌株；相反，相同的光照条件下经紫外照射后，产孢量均略高于未经紫外处理的菌株。说明紫外处理对菌株菌丝的生长具有一定的抑制作用，然而却更有利于分生孢子的产生[16]。在氮源的利用方面，添加某些氮源，如尿素和甘氨酸，与未加任何氮源相比，菌丝的生长速率缓慢，但究竟其如何抑制病原菌菌丝的生长，仍需进一步研究。而在产孢方面却是以不加氮源的对照组为最少，说明氮源对于病原菌的产孢是必不可少的[13]。在培养基pH3～11、温度10～30 ℃范围内灰葡萄孢均可生长和产孢，另外光照对于灰葡萄孢生长和产孢的影响总体来说并不明显，说明灰葡萄孢对环境的适应性较强，这也恰好与灰霉病寄主范围广、繁殖速度快、流行性广等特点相吻合[17]。

表 7 氮源对灰葡萄孢菌丝生长及产孢量统计Table 7 Statistics on the hyphae growth and conidia production of Botrytis cinerea in different nitrogen sources

表 8 灰葡萄孢菌丝及分生孢子致死温度的测定Table 8 Determination of the lethal temperature of Botrytis cinerea hyphae and conidia

对葡萄灰葡萄孢生长与产孢条件进行探索，不仅有利于认识葡萄灰葡萄孢的生物学特性和发生特点，而且在其与土壤碳、氮等养分利用关系研究方面有重要意义[18]。另外，20世纪90年代Hamada等[19]首次发表灰葡萄孢病菌转化技术，为开展灰葡萄孢分子生物学研究提供了重要的指导。但为了更好的开展灰葡萄孢分子生物学研究，建立高效的遗传转化方法，需要获得足够的分生孢子，研究对高毒力葡萄灰葡萄孢菌株SYT3-7的生长及产孢条件进行了优化，可以较好的满足开展灰葡萄孢基因功能研究时对孢子数量的要求。该试验仅对分离自山东烟台地区葡萄灰葡萄孢菌株的生长及产孢条件进行探索，然而不同地理来源、不同寄主的同种真菌生物学特性方面仍会存在一定差异[20]。因此，未来有必要对不同地理来源或寄主的灰葡萄孢菌株生长与产孢条件进行系统研究。