百日咳患儿及密切接触者的细菌培养和药物敏感性检测

雷炎玲，王红梅，张交生，邓继岿

(1.遵义医科大学珠海校区，广东珠海 519090；2.深圳市儿童医院，广东深圳 518038)

百日咳是由百日咳鲍特菌(Bordetellapertussis，Bp)引起的急性呼吸系统疾病，治疗及预防药物以红霉素等大环内酯类抗生素为首选。自1994年在美国亚利桑那州尤马县分离出第一株耐红霉素百日咳鲍特菌菌株后[1]，国内外相继出现百日咳耐药菌株；与国外百日咳耐药情况少见不同，近年来我国百日咳鲍特菌耐红霉素比例较高[2-5]。同时，百日咳的流行模式已从过去的儿童-儿童模式转变为现在的青少年(成人)-儿童模式。本研究对聚合酶链式反应(PCR)确诊的百日咳住院患儿及其密切接触者进行百日咳鲍特菌培养，并检测患儿分离株对9种抗生素的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)，为了解百日咳传播模式及临床合理用药提供参考。

1 资料和方法

1.1 研究对象

选取深圳市儿童医院2015年8月至2017年6月具有临床症状且通过PCR确诊的百日咳住院患儿及其密切接触者。百日咳的诊断标准参照《中国儿童百日咳诊断及治疗建议》2017年版标准[6]。

1.2 百日咳鲍特菌培养

在入院当天即取患儿及密切接触者的鼻咽拭子，固定采集对象头部及四肢，将藻酸钙拭子(Puritan，美国)贴鼻孔壁，沿垂直于耳垂方向慢慢转动进入其一鼻孔内，至鼻腭处(深度约为鼻尖至耳垂距离)，然后边擦拭边旋转慢慢取出；取左右两侧，接种于添加了头孢氨苄的10%的脱纤维羊血碳琼脂平皿(OXOID，英国)，立即送检并以35 ℃普通孵箱(湿度60%～70%)孵育。标本采集由经过专业培训的技术人员进行，采集前征得患儿监护人知情同意并配合。

1.3 百日咳鲍特菌鉴定

接种孵育48 h后即开始观测平皿菌落生长情况，每2 d观测一次，最长孵育10 d。百日咳鲍特菌疑似菌落：细小、圆形、光滑、凸起、银灰色、不透明的菌落，革兰染色镜下可见革兰阴性短小的球杆菌；触酶实验阳性(取少许可疑菌落均匀涂于含3% H2O2的触酶试剂的玻片上，有气泡产生)；百日咳鲍特菌血清(Remel Europe Ltd,英国)凝集反应阳性，副百日咳血清凝集反应阴性，即可判断此菌为百日咳鲍特菌，反之为副百日咳鲍特菌。

1.4 百日咳鲍特菌药敏试验

采用E-Test法检测9种抗生素阿莫西林、氨苄西林、头孢曲松、左氧氟沙星、复方磺胺甲唑、克林霉素、克拉霉素、阿奇霉素和红霉素的MIC值，药敏培养基为含10%脱纤维羊血的碳琼脂(英国OXOID公司瓶装碳琼脂粉)，25 mL/90 mm平皿。E-Test纸条购自法国BIOMERIEUX公司，操作步骤及及判读方法依照说明书检测菌株对红霉素等抗生素的MIC值；MIC 32～>256 mg/L可视为红霉素及其他大环内酯类药物耐药[1-3，7-8]，其他抗生素参考按照美国临床实验室标准化研究所CLSI2017年嗜血杆菌标准。根据MIC值判定细菌的药敏结果，MIC值在孵育第3日和第7日读取，取两者中最大MIC值。质控菌株：肺炎链球菌ATCC49619、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853及肺炎克雷伯菌ATCC700603，均购自卫生部临床检验中心。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 基本情况

本研究共收集PCR确诊的百日咳住院患儿373例，其中男223例(59.79%)；中位年龄为3(2，5)月，其中≤3个月200例(53.62%)，≤6个月313例(83.91%)，新生儿8例；经培养分离出百日咳鲍特菌136株(36.46%)。在449例密切接触者中，分离出116株百日咳鲍特菌(25.84%)，主要来自母亲(50.00%，58/116)，其次为父亲和祖母。见表1。

表1 百日咳患儿密切接触者百日咳鲍特菌分离情况

2.2 百日咳鲍特菌药敏试验结果

E-Test法提示患儿百日咳鲍特菌对红霉素等大环内酯类抗生素的敏感率为47.7%(53/111)，对复方磺胺甲唑敏感率为100%(112/112)，见表2。

表2 百日咳鲍特菌对9种常用抗菌药物的药敏试验结果

3 讨论

本研究中，PCR确诊的百日咳住院患儿共373例，其中≤3个月患儿占53.62%，与2010年美国加利福尼亚州的报告(55.13%，446/809)[9]基本一致，与中国重庆胡云鸽等[10]的研究(48.58%，120/247)也非常接近。一般认为，年龄越小，百日咳越容易出现并发症，需要住院的比例也越高[11-12]。

百日咳的典型痉挛性咳嗽症状多发生在婴幼儿人群，在青少年及成人百日咳中较为少见，往往症状轻微，或只是表现为慢性咳嗽。由于诊断手段不足和诊断意识缺乏，相当数量的成人百日咳可能被漏诊，使治疗难以及时进行，造成百日咳在家庭成员中的传播，<3个月婴幼儿尚未接种疫苗，无疑是高危人群。本研究调查了223个百日咳患儿家庭的449例家庭成员，通过培养分离出百日咳鲍特菌116株(25.84%)，绝大多数为成人，表明成人百日咳不少见，近期国内血清学调查结果也支持这一点[13-14]。这些培养阳性的密切接触者中母亲占50%(58/116)，其次为父亲和祖母，分别占19.83%和18.10%。母亲是小婴儿的最密切接触者，可以推测母亲是百日咳住院患儿主要的传染源[15]。

大环内酯类抗生素是治疗百日咳的首选药物。世界范围内细菌耐药问题日趋严重，百日咳鲍特菌对红霉素等大环内酯类抗生素耐药的现象屡见报道。目前国际上没有百日咳鲍特菌抗生素敏感试验检测方法及结果判定的统一标准，公认红霉素及其他大环内酯类药物MIC为32～256 mg/L即为耐药。尽管美国首先报道了耐红霉素百日咳鲍特菌[1]，但在欧美国家耐药并不多见，如芬兰对2006-2017年分离的148株百日咳鲍特菌，选取50株进行药敏检测，未发现有耐药株[16]；法国2012年、美国1997年也只有个别耐药株的报道[7-8]。但在中国近年来的报道中，北京、陕西西安及浙江地区对红霉素等大环内酯类耐药比例高达75.4%～91.9%，上海地区为57.5%，华南地区目前无相关数据[2-5]。本研究结果显示，深圳地区百日咳鲍特菌对大环内酯类抗生素的敏感率为47.7%，与上海地区相近，提示百日咳的耐药可能与地域有关。本研究及其他相关研究中均未发现对复方磺胺甲唑耐药的菌株，提示作为百日咳治疗选择的二线抗生素，复方磺胺甲唑对百日咳鲍特菌保持了相当好的敏感性。这些都是体外检测的结果，临床治疗效果究竟如何还需更多研究。

综上所述，百日咳住院患儿以3个月以下小婴儿多见，母亲可能是主要传染源，深圳地区百日咳鲍特菌对大环内酯类抗生素耐药较常见，未发现对复方磺胺甲唑耐药的菌株。