黑木耳醇提物清除自由基能力及对α-淀粉酶抑制效果研究

刘天一 李明玉 邵志悦 季启天 王 萍，2*

（1东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040；2黑龙江省森食品资源利用重点实验室，黑龙江哈尔滨 150040）

黑木耳（Auricularia auricula）又称木耳、桑耳、云耳等，属担子菌亚门，担子菌纲，木耳科，木耳目，木耳属[1]。现代科学研究表明，木耳子实体中含有多种活性物质，包括黑木耳多糖、黑色素、胶原蛋白、多酚和黄酮类化合物以及钙、铁、锌、锰等微量元素[2]，具有抗氧化[3]、降血脂[4-5]、降血糖[6]、抑菌[7]、抗凝血[8-9]、抗肿瘤[10-11]、抗辐射[12]等功效，为营养丰富的药食同源食用菌，具有较高的营养价值及医药价值。

自由基是生物体内的一种活性物质，具有一定功能。但研究表明，过量的自由基会干扰、破坏人体内的正常代谢，破坏正常细胞和组织，造成蛋白质、DNA 等生物大分子的损伤，引起糖尿病、高血压、心血管疾病、老年痴呆、癌症等多种疾病[13-15]。常见的自由基有DPPH·、OH·、ABTS+·、O2-，其中，DPPH·、ABTS+·因其性质稳定，试验操作方便，成为评价天然产物自由基清除能力的常用方法。糖尿病作为慢性非传染性代谢疾病，在现代社会中已经成为威胁到人类生命健康的关键因素，其主要特征表现为高血糖，因此控制住人体血糖水平是有效减缓糖尿病的重要措施[16]。α-淀粉酶能够水解淀粉，促进其消化，从而导致人体餐后血糖水平升高，因此抑制α-淀粉酶就能够有效阻止淀粉水解，从而控制糖尿病的发展[17]。

现阶段多是以某一具体成分对于黑木耳进行功能性评价，对于粗提物进行评价的很少，并且降血糖功能评价多以动物试验为主，国内对酶法抑制研究降血糖报道较少。因此笔者通过不同黑木耳醇提物对α-淀粉酶的活性抑制进行体外降血糖功能评价，同时进行体外抗氧化活性评价，为黑木耳相关食品的开发利用提供研究数据以及理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料与试剂

黑木耳，购自大兴安岭；α-淀粉酶、DPPH、ABTS 购自上海源叶科技有限公司，无水乙醇、3，5-二硝基水杨酸、可溶性淀粉均为分析纯。

1.2 仪器与设备

PHS-3C 型精密pH 计，上海精密仪器有限公司；TU-1810 型PC722s 分光光度计，上海精密仪器有限公司；DK-S12 电热恒温水浴锅，上海森信试验仪器有限公司；EPOCH12 酶标分析仪，BioTek Instruments，Inc。

1.3 试验方法

1.3.1 黑木耳粉的制备

将干黑木耳与水以体积比1∶25 的比例泡发2 h，将泡发后的黑木耳沥干再放置于托盘中，放于37 ℃烘箱中烘干8 h，将烘干后的黑木耳放入粉碎机粉碎，收集颗粒为0.178～0.420 mm的黑木耳粉。

1.3.2 醇提物的制备

将黑木耳粉分别与5组不同体积分数（30%、40%、50%、60%、70%）的乙醇以料液比1∶60 置于40 ℃恒温水浴锅中3 h，将粗提物进行过滤并旋转蒸发至相同体积得到提取液，之后置于37 ℃烘箱中烘干至恒重，用保鲜膜密封冻存。

1.3.3 对DPPH·清除率测定

参照SUN 等[18]方法略作修改。精确吸取0.5 mL提取液、2.5 mL 0.1 mM DPPH-乙醇溶液并均匀混合，避光反应30 min，用去离子水作为参比；对照组采用2.5 mL 无水乙醇代替DPPH 工作液；空白组采用0.5 mL 无水乙醇代替样品溶液，于517 nm 波长处测定吸光值，计算清除率。

式中，A1为样品组吸光值，A2为对照组吸光值，A3为空白组吸光值。

1.3.4 对ABTS+·清除率测定

参照GARZÓN 等[19]方法略作修改。准确吸取0.2 mL 提取液、4.0 mL ABTS 工作液（2.6 mmol/L K2S2O8溶液与7.4 mmol/L ABTS 溶液等体积均匀混合，避光反应12 h，用pH7.4 的PBS 溶液稀释40～50倍，令其在734 nm波长处吸光值为（0.7±0.02）。二者震荡充分混匀，静置6 min，于734 nm 波长处测定吸光值；空白组采用蒸馏水代替提取液，计算清除率。

式中，A0为空白组吸光值，A为样品组吸光值。

1.3.5 抑制α-淀粉酶活性测定

参照HARA 等[20]方法略作修改。准确吸取50 μL 提取液、50 μL α-淀粉酶溶液（6 U/mL）于试管中混合均匀。在30 ℃下孵育10 min 后，加入800 μL 0.5%的可溶性淀粉（含pH6.8 0.1 mol/L PBS缓冲液）。继续在30 ℃下孵育20 min 后，加入125 μL 2 mol/L NaOH 溶液和125 μL DNS 试剂终止反应。在99 ℃沸水浴下加热10 min 后迅速冷却至室温，在540 nm波长处测定吸光值，计算抑制率。

式中，A3为加入样品溶液和加入α-淀粉酶溶液的吸光值，A4为加入样品溶液和不加入α-淀粉酶溶液的吸光值，A1为不加入样品溶液和加入α-淀粉酶溶液的吸光值，A2为不加入样品溶液和不加入α-淀粉酶溶液的吸光值。

1.4 数据处理与分析

所有数据平行测定三次，结果用X±SD 表示，采用SPSS 21 进行数据处理、Origin 8.5 进行作图，以P＜0.05作为统计学差异。

2 结果与分析

2.1 黑木耳乙醇提取物对DPPH·清除能力

DPPH·清除能力结果如图1所示。

图1 不同体积分数乙醇黑木耳提取物对DPPH·清除能力

DPPH·是一种稳定的自由基，当加入自由基清除剂时，孤对电子被配对，DPPH·被清除。由图1可知，随着乙醇体积分数的升高，乙醇提取物对DPPH·清除率整体呈现先升高后下降的趋势，各组清除率存在显著性差异。体积分数50%乙醇提取物的清除率达到最大值，为（44.74±0.74）%，明显较其他体积分数乙醇提取物清除能力高。汪璐等[21]研究表明，随着黑木耳醇提物浓度的升高，对DPPH·清除率呈上升趋势，1.6 mg/mL 95%乙醇体积分数的黑木耳醇提物对DPPH·自由基的清除率为40.43%，试验较其他效果略好。结果表明，黑木耳醇提物具有清除DPPH·的功能，不同乙醇体积分数的黑木耳提取物效果不同，体积分数50%乙醇提取物的清除率达到最大值，推测随着乙醇体积分数的升高，提取溶剂极性逐渐减小，活性成分含量呈先增后减趋势，乙醇体积分数50%时醇提物浓度最高，从而对DPPH·清除效果最好。

2.2 ABTS+·清除能力

图2 不同乙醇体积分数对ABTS+·的清除

ABTS+·清除能力如图2 所示。ABTS 被氧化后生成稳定的蓝绿色自由基阳离子ABTS+·，当抗氧化剂存在时，ABTS+·与其反应被清除。随着乙醇体积分数的升高，ABTS+·的清除率呈现先上升后下降的趋势。体积分数60%乙醇醇提物清除率达到最大值，为（68.38±1.34）%，根据显著性分析各组黑木耳醇提物对ABTS+·清除率差异不显著。由于使用的粗提物未进行纯化，因此结果与翟雅琴[22]研究结果存在一定差异。但结果表明，黑木耳醇提物具有清除ABTS+·的功能，可抑制其在机体内引发的过氧化反应，有效维持体内自由基平衡。

2.3 黑木耳乙醇提取物对α-淀粉酶活性抑制

α-淀粉酶是糖代谢过程中的一种酶，能够促进淀粉消化，引起血糖升高。抑制α-淀粉酶活性，可阻碍食物中碳水化合物的水解和消化，从而控制血糖的升高，达到降血糖的目的。如图3所示，随着样品浓度的升高，黑木耳醇提物对α-淀粉酶的抑制率呈现增强的趋势。在5 组乙醇体积分数提取条件下，乙醇体积分数60% 的醇提物IC50最大，为127.819 mg/mL；而乙醇体积分数30%的醇提物IC50最小，为49.57 mg/mL，对α-淀粉酶的活性抑制效果最好，因此具有更高效的降血糖功效。

图3 不同体积分数乙醇醇提取物对α-淀粉酶的活性抑制

3 小结

对黑木耳醇提物的自由基清除能力和α-淀粉酶的抑制进行了体外研究评价，结果表明在料液比1∶60、水浴温度40 ℃、浸提时间3 h 的条件下，对DPPH·的清除、ABTS+·的清除、α-淀粉酶的活性抑制效果最显著时所对应的乙醇体积分数分别为50%、60%和30%。黑木耳醇提物具有比较显著的抗氧化和降血糖功效，其数据为开发黑木耳降血糖及抗氧化药物和食品提供了理论依据。但黑木耳醇提物仍具有潜在的开发研究价值，目前关于纯化后的黑木耳醇提物降血糖功效的研究甚少，体内含有的活性物质和功能的相关性也仍需要进一步探究。