LC-MS/MS测定豆芽中4-氯苯氧乙酸钠和6-苄基腺嘌呤

李碧波，杜鹏程，裴娟娟

仙桃市公共检验检测中心（仙桃 433000）

豆芽是日常生活中常见的蔬菜，不仅营养丰富，甚至还能治疗一些常见病，有良好药用价值[1-3]，深受人们喜爱。然而，一些豆芽的无良商家为达到高产量、高质量目的，生产过程中滥用各种违禁药物，主要包括4-CPA-Na和6-BA等，对人体健康造成恶劣影响。根据国家市场监督管理总局食品安全抽检公布结果查询系统不完全统计，自2014年—2020年3月底，站内统计抽检黄豆芽近7 500批次，绿豆芽近7 800批次，豆芽近4 100批次，总计约2万批次。其中，不合格批次超过2 100批次，约占总数的10.8%，且不合格项主要涉及4-CPA-Na和6-BA，在食品安全监管领域是一个突出问题难题。

关于豆芽中的检测方法主要以液相色谱法、液相色谱质谱联用法为主，相关标准、文献检测方法[4-8]均采用不同方法对单一组分分别检测，工作量大，难以满足实际的检测需要。同时测定的方法也有很多[9-11]，但在豆芽样品的前处理过程中均涉及固相萃取小柱净化或氮吹浓缩，使得前处理过程极其复杂繁琐，降低检测效率的同时，也增加污染风险。通过优化提取方法和净化环节，只需将样品提取、纯化、稀释即可进样，结合液相色谱串联质谱联用仪高灵敏度特性，建立便捷高效的豆芽中4-CPA-Na和6-BA的检测方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

Ultimate 3000液相串联TSQ Quantum Access Max质谱系统（美国Thermo Fisher Scientific，配有格林威尔氮气发生器）；台式高速冷冻离心机（TGL16M，湘立科学仪器有限公司）；涡旋混合器（Vortex 3000，Wiggens）；组织捣碎机（博朗食品加工机FP 3010，Braun）；电子分析天平（MS205DU，瑞士Mettler-Toledo公司）；超声清洗机（410HT，深圳洁拓科技）。

4-氯苯氧乙酸钠（4-CPA-Na，标准品250 mg，纯度≥99.0%，CAS NO 13730-98-80，美国阿尔塔）；6-苄基腺嘌呤（6-BA，标准品，纯度≥99.38%，CAS NO 1214-39-7，Stanford chemicals）；甲醇、乙腈（色谱纯，Fisher Chemical）；C18粉末（博纳艾杰尔科技有限公司）；其他试剂（均为国药集团化学试剂有限公司）；PCX小柱（艾杰尔混合阳离子交换小柱）。

豆芽样品（流通环节监督抽检样品）。

1.2 样品前处理

取适量豆芽样品用博朗食品加工机粉碎均匀后封存备用。准确称取10.000 g处理好的豆芽样品于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL 5%乙酸乙腈，振摇1 min，超声5 min，加入氯化钠、无水硫酸镁各1.0 g，涡旋振荡2 min，8 000 r/min离心5 min，恢复室温后，吸取5 mL上清液于15 mL离心管中，加入150 mg C18粉末，涡旋振荡，以8 000 r/min离心5 min，恢复室温后，吸取100 μL上清液，用空白基质提取液定容至1 mL，涡旋振荡1 min，过0.22 μm针式过滤膜，供LCMS/MS分析。

同时选取不含4-CPA-Na、6-BA的豆芽样品，按上述处理方法制备空白基质提取液。

1.3 标准系列溶液的配制

4-CPA-Na、6-BA标准品用十万分之一天平分别准确称取0.100 0 g；用合适溶剂溶解，甲醇定容；配制成4-CPA-Na、6-BA含量1.0 mg/mL标准储备溶液。甲醇稀释成100.0 ng/mL中间浓度作为混合标准使用溶液。分别准确吸取一定体积混合标准使用液于进样瓶中，加空白基质提取液定容至1 mL，临用时现配；配制成质量浓度依次为0.1，0.5，1.0，2.0，5.0和20.0 ng/mL的标准溶液系列。

1.4 仪器分析条件

液相色谱参数：色谱柱，赛默飞原装Hypersil GOLD™ C18（3 μm，150 mm×2.1 mm）；流动相A，5 mmol乙酸铵溶液；流动相B，乙腈；流动相流速0.30 mL/min；进样体积20 μL。柱温35 ℃。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

质谱各项性能参数见表2，目标化合物的SRM条件见表3。

表2 质谱参数条件

表3 4-CPA-Na和6-BA的SRM条件

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法的选择

4-CPA-Na易溶于水、酸化甲醇和酸化乙腈；6-BA在甲醇和乙腈中的溶解度较高，难溶于水，但降低水系提取液中pH时，6-BA能达到稳定的溶解度；因此试验考察分别用0.1 mol/L盐酸、甲醇、乙腈作为提取液时4-CPA-Na和6-BA的加标回收率，同一浓度重复测定5次，加标回收率见表3。结果表明，3种提取溶剂都能兼顾4-CPA-Na和6-BA的加标回收率。以0.1 mol/L盐酸作提取液时，因强酸溶液不能直接进入质谱检测器，需使用PCX小柱固相萃取吸附、洗脱以置换溶剂，该过程可能造成目标化合物的丢失，致使回收率稍低，且使用固相萃取小柱会提高检测成本，样品净化过程耗时更长。使用甲醇和乙腈作提取液时发现，乙腈作提取液时的目标化合物的峰型要更尖锐对称，原因可能是豆芽中的蛋白含量及脂类含量要高于一般蔬菜，使用乙腈提取时能沉淀蛋白振荡从而降低基质干扰。综合考量，选用乙酸乙腈作为4-CPA-Na和6-BA的提取溶剂。超声提取后加入氯化钠，无水硫酸镁使水相和样品中水分和乙腈分层，离心后取上清液加入C18粉末净化，能达到理想的提取净化效果。根据液相色谱-串联质谱基质效应及其消除方法[12]中传统消除基质效应的方法，进样前将样品稀释能减少本底进样量达到进一步降低基质效应的目的。

2.2 质谱条件的优化

将4-CPA-Na和6-BA含量100.0 ng/mL的标准使用溶液通过注射泵直接进入质谱，进行正负离子全扫描，通过调整鞘气流速、辅助气流速、雾化温度等使目标化合物的母离子m/z得到最优响应值。

4-CPA-Na在负离子模式下响应值稳定，采用负离子扫描模式；6-BA可产生[M+H]+离子峰m/z226，也可产生[M-H]-离子峰m/z224，正负离子扫描均有响应，同一浓度时离子峰m/z226响应值优于m/z224，见图1和图2；6-BA在正离子扫描模式下灵敏度更高，应选用离子峰m/z226。选择反应监测（SRM）模式，自动优化Tube Lens、碰撞能量，得到几对不同的离子对，选取184.98＞127.0，184.98＞141.10作为4-CPANa定量、定性离子，226.07＞91.2，226.07＞65.3作为6-BA定量、定性离子。

表4 不同提取溶剂4-CPA-Na和6-BA回收率

图1 6-BA负离子模式下的母离子图

图2 6-BA正离子模式下的母离子图

2.3 色谱条件的优化

优化色谱条件需要考虑色谱峰的峰型、分离效果及保留效果等参数的影响，色谱柱及流动相的选择起关键性的作用。通过比较Hypersil GOLD™ C18（3 μm，2.1 mm）色谱柱150 mm和100 mm 2款，结果发现100 mm色谱柱在保留效果、分离效果上较低，目标化合物出峰快，与样品中存在的杂质未有效分离，会降低电喷雾接口处4-CPA-Na和6-BA的离子化效率，影响质谱检测灵敏度；150 mm色谱柱的峰型、分离效果及保留效果良好，2种化合物能达到一定分离度，且保留时间比较合适，有利于分析判断。因此选择Hypersil GOLD™ C18（3 μm，150 mm×2.1 mm）色谱柱。

流动相方面分别考察纯水、添加0.1%甲酸水、乙酸铵水溶液及添加0.1%甲酸的乙酸铵水溶液作为流动相A，以乙腈作为流动相B。试验发现，用纯水+乙腈体系作为流动相时4-CPA-Na和6-BA峰型均存在严重峰拖尾现象，化合物之间互相干扰，影响检测结果的准确性。以5 mmol/L乙酸铵水溶液或添加体积分数0.1%甲酸水溶液作为流动相A时，峰型得到明显改善，但流动相中存在甲酸时4-CPA-Na离子强度受到明显抑制，乙酸铵水溶液存在于流动相中时6-BA离子强度有一定抑制，通过降低乙酸铵水溶液浓度6-BA离子强度逐步增强，乙酸铵水溶液浓度为5 mmol/L时达到最优。最终选定5 mmol/L乙酸铵水溶液+乙腈作流动相，梯度条件洗脱。

2.4 方法检出限、定量限及线性关系

通过LC-MS/MS分析基质空白提取液、加标样品、基质匹配标准溶液系列，得到空白样品、加标样品的SRM谱图，如图3和图4所示；标准曲线、线性方程如图5所示。结果表明，4-CPA-Na和6-BA在0.1～20 ng/mL质量浓度区间有良好线性关系。

根据林国斌等[13]方法检出限的确定，根据公式方法检出限（MLD）=k×Sb×C/X计算，其中，C为标液浓度；k为置信因子，一般取3，确定4-CPA-Na检出限位0.4 μg/kg，6-BA检出限0.125 μg/kg；依据定量限（LOQ）与方法检出限（MLD）的近似数量关系a（MLD）∶a（LOQ）=4∶10得到4-CPA-Na的定量限1.0 μg/kg，6-BA定量限0.50 μg/kg。

图3 空白样品4-CPA-Na和6-BA的SRM谱图

图4 加标质量浓度0.5 ng/mL时4-CPA-Na和6-BA的SRM谱图

图5 标准曲线图

2.5 精密度和回收率

选取不含4-CPA-Na、6-BA的豆芽样品，分别添加1.0，5.0和20.0 ng/mL 3种水平进行加标回收测试，按试验方法进行处理、测试；平行重复测定5次，得到平均回收率、相对标准偏差（RSD），见表5。

2.6 样品检测

对流通环节抽检的50个豆芽样品进行分析，4批次样品检出含有4-CPA-Na或6-BA，其中4-CPA-Na 3次检出，最高含量2.24 μg/kg，6-BA 2次检出，最高含量0.97 μg/kg。总体不合格率达到8.0%，可见豆芽中2种药物滥用现象严重，必须加强监管。

表5 4-CPA-Na和6-BA平均回收率和精密度

3 结论

根据4-CPA-Na和6-BA特性，建立液相色谱质谱联用系统测定豆芽菜中4-CPA-Na和6-BA含量的方法，通过比较各种样品前处理方法，优化仪器条件，使整个试验过程更加简洁快速，且方法的灵敏度高，再现性好，完全满足《国家食品安全监督抽检实施细则》对于豆芽中2种药物的检测分析。