酸枣仁水提物的活性炭脱色工艺及应用

刘星，秦楠，李铭柔，王小敏，郭丽丽

山西中医药大学中药与食品工程学院（晋中 030619）

随着人们生活压力的增大及社会节奏的加快，我国的失眠人群数量不断扩大，改善睡眠的产品开发与研究备受消费者及科研工作者的关注。酸枣仁是一种常见的药食两用中药，为鼠李科植物酸枣的种子，主要功能为调节神经、镇静催眠、滋养肝脏，在临床及生活中多用于调节失眠[1]。酸枣仁是改善睡眠类产品中较为常见的一种原料，现代研究已表明其所含的皂苷类化合物是其发挥镇静催眠的主要有效成分。越来越多的相关产品趋向于以酸枣仁提取物为原料来开发功能食品，而不是采用简单的原药材打粉的初加工形式。然而，酸枣仁水提物或醇提物颜色较深，大量色素的存在会影响最终产品的感官及后续的质量分析，有必要对酸枣仁提取物进行脱色。

活性炭吸附是常见的、较为成熟的一种脱色方法。活性炭表面积大、结构稳定、吸附性高，能与溶液中的色素和杂质分子充分接触，从而达到脱色的目的[2]。试验采用活性炭吸附法对酸枣仁水提物的脱色工艺进行系统优化，以期为酸枣仁及其组方方剂在功能食品开发与研究中的精深应用奠定理论与实践基础。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与设备

酸枣仁（产地山西，经山西中医药大学中药鉴定教研室鉴定，亳州成源中药饮片有限公司）；川芎、茯苓、甘草、知母（经山西中医药大学中药鉴定教研室鉴定，河北药香商贸专业中药材批发部）；酸枣仁皂苷A标准品（批号181205，上海融禾医药科技有限公司）；粉末活性炭（济南恒晟环保科技有限公司）；甲醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸等均为分析纯。

ULTRA-3600紫外-可见分光光度计（北京普源精电科技有限公司）；SHA-B数显水浴恒温振荡器（常州金坛恒丰仪器制造有限公司）；KW-1000DC数显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；AR223CN分析天平（美国奥豪斯仪器有限公司）；GZX-9140MBE电热鼓风干燥箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；SHZ-D（III）循环水式真空泵（巩义市予华仪器责任有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 酸枣仁水提物的制备[3]

称取适量酸枣仁，加10倍量水浸泡50 min，煎煮40 min，煎煮2次，合并煎煮液得酸枣仁水提液。

1.2.2 酸枣仁总皂苷含量的测定

以酸枣仁皂苷A为对照品，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法测定酸枣仁总皂苷的含量[4]。准确吸取20，50，100，150，200，250和300 μL标准品溶液（0.8 mg/mL）或100 μL样品溶液于10 mL具塞试管中，加热挥尽溶剂，分别加入1 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和4 mL高氯酸，混匀后于65 ℃水浴中加热20 min，冰浴冷却至室温，在490 nm处测吸光度，由回归方程求得酸枣仁总皂苷的含量。

1.2.3 脱色工艺的单因素试验

取若干小锥形瓶，分别向其中加入20 mL酸枣仁水提液，在一定的活性炭用量（0.2%，0.4%，0.6%，0.8%和1.0%）、脱色温度（20，30，40，50和60℃）、脱色时间（5，10，15，20和25 min）和搅拌速度（90，120，150，180，210和240 r/min）下对酸枣仁水提液进行脱色，抽滤得滤液后分别测定皂苷保留率和脱色率，并计算综合评分，其中各因素固定水平为活性炭用量0.8%、脱色温度20 ℃、脱色时间15 min、搅拌速度120 r/min。

脱色工艺中所用的活性炭预处理方法[5]：将活性炭用5%盐酸溶液浸泡过夜，沸煮30 min，用去离子水洗至中性，于120 ℃烘干备用。

1.2.4 脱色工艺的响应面试验

在单因素试验基础上，进一步研究活性炭用量（A）、脱色温度（B）和脱色时间（C）3个因素之间的交互作用，以由脱色率和皂苷保留率组成的综合评分为指标，采用Design-Expert软件，应用Box-Behnken原理进行三因素三水平试验（共17组），从而确定最优的脱色工艺。响应面因素水平编码表如表1所示。

综合评分采用加权法，总分100分，将脱色率和皂苷保留率两者的权重值均设为50，按照式（1）计算综合评分。

1.2.5 脱色效果指标的测定

通过测定脱色率和皂苷保留率综合评价脱色效果。脱色率的测定方法：取20 mL酸枣仁水提液加入适量活性炭进行脱色，抽滤分离活性炭后得脱色后滤液，在410 nm处分别测定脱色前后水提液的吸光度，按式（2）计算脱色率[6]：

皂苷保留率的测定方法：取20 mL酸枣仁水提液加入适量活性炭进行脱色，抽滤分离活性炭后得脱色后滤液，将该滤液置于水浴锅中浓缩10倍后作为脱色后样品溶液。同理，从等量酸枣仁水提液中制得脱色前样品溶液，然后按1.2.2小节测定脱色前后水提液中的总皂苷含量，并按式（3）计算皂苷保留率[6]。

1.2.6 脱色工艺的初步应用

鉴于采用组方方剂是开发功能保健食品的一种有效途径，该部分将优化出的脱色工艺用于重用酸枣仁的方剂酸枣仁汤[7]中（组方包含酸枣仁15 g、川芎6 g、茯苓6 g、知母6 g、甘草3 g，用于去心火、治失眠），通过比较脱色前后提取液的色泽，评价脱色工艺的实际应用效果。按规定用量将酸枣仁汤各味药材浸泡50 min后煎煮40 min，煎煮2次，将煎煮液进行抽滤，得一定体积脱色前水煎液。然后按前述脱色工艺将22.5 g单味中药酸枣仁水提物脱色，将此脱色液与其余中药煎煮液（甘草、知母、茯苓、川芎）混合制成等体积脱色后水煎液。将上述脱色前及脱色后水煎液分别在410 nm处测定吸光度，采用1.2.5小节公式计算得出脱色率，从而评价脱色工艺的应用效果。

需要说明的是，为保证活性成分的含量不变，此处以脱色前后酸枣仁皂苷的含量相等为依据，按脱色后66.70%的皂苷保留率计。经计算可知，脱色后的22.5 g酸枣仁用量相当于原方中的15 g酸枣仁用量，因此脱色前后方剂中酸枣仁原料用量有所不同。

1.3 数据分析

采用Origin 9.0软件进行统计分析和绘图，结果以3次平行的“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 酸枣仁皂苷的标准曲线

按照1.2.2所述，酸枣仁皂苷A的线性回归方程为y=0.024 3x+0.034 2（R2=0.993 3），结果表明酸枣仁皂苷A在质量浓度范围3.20～48.00 μg/mL内呈良好线性关系。

2.2 脱色工艺的单因素试验

2.2.1 活性炭用量对脱色工艺的影响

如图1所示，活性炭用量在0.2%～1.0%范围内，脱色率与活性炭用量呈明显的正比关系，同时皂苷保留率与活性炭用量呈反比。这是由于活性炭用量的增加会增大吸附比表面积，相应的吸附量也逐渐升高[8]，使得溶液中的色素分子及皂苷类物质越来越多地被吸附，从而出现脱色率不断上升、皂苷保留率不断下降的现象。

图1 活性炭用量对酸枣仁水提物脱色率与皂苷保留率的影响

图2为活性炭用量对脱色效果的影响，随着活性炭用量的增加，脱色效果综合评分总体呈先上升后下降的趋势，其中0.8%活性炭用量下的综合评分最高。综合考虑脱色效果与皂苷保留情况，选取活性炭用量0.6%，0.8%和1.0%作为响应面优化的3个水平。

图2 活性炭用量对酸枣仁水提物脱色效果综合评分的影响

2.2.2 脱色温度对脱色工艺的影响

如图3所示，脱色率随脱色温度的提高呈先上升后基本不变的趋势，这是由于温度升高，体系的黏度减小，增强了分子的扩散运动从而加强了色素颗粒与活性炭之间的吸附传质，使脱色率不断上升[9]。当着色物质与活性炭的吸附达到平衡时，脱色率不再升高。皂苷保留率随脱色温度的升高呈先上升后下降的趋势，这可能是由于20 ℃的较低温度比较有利于酸枣仁皂苷分子的吸附，使得皂苷保留率较小；随着温度的升高，分子运动增强，其他分子不断被竞争吸附的同时促进了酸枣仁皂苷的解吸，因此30 ℃时皂苷保留率升高且达到最大；此时溶液中皂苷浓度的增大又会促进正吸附，使得温度继续升高时酸枣仁皂苷保留率发生下降。

如图4所示，随着脱色温度的提高，脱色效果综合评分呈先上升后下降的趋势，且脱色温度为30 ℃时综合评分最高，说明脱色温度确实不宜过高，否则在影响脱色效果的同时还可能引起皂苷类活性物质的变化。综合考虑，选取脱色温度20，30和40 ℃作为响应面优化的3个水平。

图3 脱色温度对酸枣仁水提物脱色率与皂苷保留率的影响

图4 脱色温度对酸枣仁水提物脱色效果综合评分的影响

2.2.3 脱色时间对脱色工艺的影响

如图5所示，随着脱色时间的延长，脱色率总体呈上升趋势，而皂苷保留率呈下降趋势。这可能是由于活性炭脱色是一个动态的吸附与解吸过程，而吸附平衡的达到需要一定的时间[10]，在试验所用的25 min脱色时间范围内，尚未到达完全吸附平衡，而是处于吸附大于解吸的过程，因而脱色率不断升高、皂苷保留率不断下降。

图5 脱色时间对酸枣仁水提物脱色率与皂苷保留率的影响

如图6所示，以脱色时间20 min的综合评分较其他时间略高，因此将脱色时间15，20和25 min作为响应面优化的3个水平。

图6 脱色时间对酸枣仁水提物脱色效果综合评分的影响

2.2.4 搅拌速度对脱色工艺的影响

如图7所示，随着搅拌速度的逐渐加快，脱色率逐渐增加，当搅拌速度达到150 r/min时，脱色率大幅提高，之后继续增加搅拌速度，脱色率也基本保持不变；皂苷保留率的变化与脱色率正好相反，呈先逐渐下降后基本不变的趋势。这可能是由于搅拌速度的增加可以促进分子的扩散运动，从而加快活性炭的吸附作用[11]，使得脱色率不断上升、皂苷保留率不断下降；但是当吸附接近平衡时，即使继续增大搅拌速度，脱色率和皂苷保留率也无明显变化。

图7 搅拌速度对酸枣仁水提物脱色率与皂苷保留率的影响

如图8所示，不同搅拌速度对综合评分的影响不是很大，基本都在87分左右，因此在响应面优化时将搅拌速度固定为150 r/min，不再作进一步考察。

图8 搅拌速度对酸枣仁水提物脱色效果综合评分的影响

2.3 脱色工艺的响应面优化

2.3.1 响应面试验的结果及方差分析

表2为17组试验的结果。对试验数据进行二次多元回归拟合，得回归模型方程：综合评分Y=93.47-2.57A+2.24B+1.97C-3.33AB-0.60AC-1.00BC-6.23A2-2.59B2-5.48C2。

表2 Box-Behnken试验设计与结果

由表3的回归模型方差分析可知，一次项A、B、C，二次项A2、B2、C2以及交互项AB对脱色效果有极显著的影响（p＜0.01）。F值反映出各因素对响应值影响强弱的顺序：A＞B＞C。方程的模型极显著（p＜0.000 1），失拟项不显著（p＞0.05），模型的校正决定系数R2Adj=0.975 5，说明模型可解释97.55%的响应值变化，表明模型成立。变异系数为1.04%，信噪比为22.630＞4，表明试验本身精确度高，结果可靠性大，回归方程拟合度良好。

表3 Box-Behnken试验方差分析

通过响应面图可更直观分析各因素对响应值的影响以及各因素间的交互效应。响应面的坡度反映各因素变化对响应值的影响，坡度越陡峭，则响应值对该因素的变化越敏感；坡度越平缓，说明该因素对响应值的影响越小。等高线的形状及疏密程度则反映了两因素交互效应的强弱，等高线呈椭圆形且曲线密集体现其互作效应对响应值的影响显著，若为圆形且曲线稀疏则影响不显著[12]。如图9所示，活性炭用量与脱色温度的等高线（图9a）呈椭圆形，说明两者交互作用显著；图9（b）和图9（c）的等高线呈圆形，说明活性炭用量与脱色时间两因素、脱色温度与脱色时间两因素之间的交互作用不明显，结果与方差分析结果一致。根据二次多元回归方程的拟合，得到最佳脱色工艺的预测值：搅拌速度150 r/min、活性炭用量0.72%、脱色温度36.58 ℃、脱色时间20.71 min。此时最佳综合评分为94.84分。

2.3.2 最佳工艺条件的验证

根据最佳工艺预测值将试验条件确定为活性炭用量0.70%，脱色温度36.50 ℃、脱色时间20.7 min，搅拌速度150 r/min。重复3次，计算平均值，此时脱色率为91.08%，皂苷保留率为66.70%，综合评分为94.21分，接近预测值，说明得到的最佳工艺条件可靠。

图9 脱色工艺优化的响应面图

2.4 脱色工艺的初步应用

以经典的酸枣仁汤为例，利用上述优化后的脱色工艺将当量的单味酸枣仁水煎液进行脱色后，再将脱色液与其他药材煎煮液混合，得到如图10（b）所示的煎煮液。与图10（a）的传统煎煮液相比，采用脱色工艺后的水煎液颜色明显减淡，综合脱色率为63.73%，脱色效果显著。此时酸枣仁总皂苷含量相当，约为20 μg/mL，说明该脱色工艺可在保证产品功效成分基本不受影响的前提下，摆脱传统中药水煎提取液在应用于新型食品研究与开发过程中颜色过深的问题，从而促进以酸枣仁为主药的经方与名方在功能食品开发中的应用，在延伸中药材产业链的同时促进食品工业的发展。

图10 酸枣仁汤脱色前后效果比较

3 结论

活性炭吸附可用于酸枣仁水提物的脱色，以由脱色率和皂苷保留率所组成的脱色效果综合评分为指标，通过单因素试验结合响应面法得到酸枣仁水提物的最佳脱色工艺：活性炭用量0.7%，脱色温度36.5℃，脱色时间20.7 min，搅拌速度150 r/min。最佳工艺下脱色率为91.08%，皂苷保留率为66.70%，综合评分为94.21分。所得脱色工艺在酸枣仁汤的脱色应用中效果显著，组方水提液颜色明显减淡，为酸枣仁及其组方方剂在功能食品中的精深开发和有效应用提供了科学依据与实践基础。