猪流行性腹泻病毒入胞机制研究现状

陈 思，张丽颖，蒋洪忠，任林柱

(吉林大学动物科学学院，吉林长春 130062)

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)α冠状病毒(Alphacoronavirus)。该病毒主要感染猪肠道上皮，导致绒毛萎缩、吸收不良，引起新生仔猪急性腹泻、呕吐、脱水和高病死率。PEDV主要通过粪-口直接接触传播，也可形成气溶胶并通过粪-鼻途径传播[1]。

猪流行性腹泻在20世纪70年代后期首次出现在英国和比利时[2]。我国于1973年首次报道猪流行性腹泻病例；随后，包括韩国和日本在内的其他亚洲国家也相继暴发该病[2]。2010年10月之后我国开始大规模暴发该病[2]。目前，PEDV已成为亚洲仔猪腹泻的主要原因，是世界上最严重的猪病毒性疾病之一，给生猪行业的发展产生了巨大影响，造成了重大经济损失。

本文主要针对国内外近期在PEDV的组织和细胞嗜性、细胞受体、入胞方式、细胞蛋白酶方面的研究进展进行综述，以期为后续PEDV的研究提供参考。

1 PEDV的组织和细胞嗜性

病毒在特异组织和细胞中的复制能力是决定其组织嗜性的重要因素。PEDV在肠道具有组织嗜性，哺乳猪感染急性PEDV的12 h～24 h内，PEDV主要感染空肠和回肠，其次是空肠近端和十二指肠[3]。幽门不是急性PEDV感染的部位，而大肠的绒毛肠细胞经常被感染，但感染的结肠上皮细胞无坏死病变。与结肠肠上皮细胞不同的是，PEDV感染的小肠绒毛肠上皮细胞会发生急性坏死并从固有层剥落，导致小肠中明显的绒毛萎缩或融合[1]。PEDV可能不会在体内诱导肠道绒毛肠细胞凋亡，但体外感染PEDV的非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)会发生凋亡[1]。

PEDV感染早期定位在小肠的绒毛-隐窝界面，而不是在绒毛尖端中。PEDV最先感染未成熟的肠细胞，随后感染至空肠上部，直至感染整个空肠的绒毛上皮[1]。除了通过粪-口传播，PEDV还能够经过鼻腔黏膜下的树突状细胞的摄取进入鼻腔黏膜固有层，随后摄取PEDV后的树突状细胞迁移至附近淋巴结，通过病毒突触将PEDV传递给淋巴细胞，而后携带PEDV的淋巴细胞又能经淋巴循环和血液循环迁移至肠黏膜，并将病毒传递给肠上皮细胞引起致病[3]。PEDV在体内除主要感染猪小肠上皮细胞外，还感染杯状细胞和隐窝干细胞[4]，也能够在仔猪鼻腔上皮中进行低水平复制[3]。

PEDV的S蛋白既具有受体结合能力又具有膜融合能力，S蛋白是决定组织和细胞嗜性以及宿主范围的关键因素，但PEDV的细胞适应性差。自PEDV发现以来，科研人员尝试了很多方法将病毒适应于细胞培养。1984年宣华等首次报道了在胎猪肠组织单层细胞上培养PEDV，但因胎猪肠组织不易获得，未得到广泛应用。直到1988年，Hofmann等通过向Vero细胞培养基中添加胰蛋白酶，使PEDV成功适应于Vero细胞。其后，日本和韩国也相继报道PEDV在Vero细胞上培养成功。我国李树根、钱永清等也成功地在体外实现PEDV的细胞培养。

目前PEDV的分离培养多数需要在细胞培养基中添加胰蛋白酶，可能是由于蛋白酶在PEDV侵入细胞和细胞释放PEDV病毒粒子方面起着重要作用。但是，不同来源的PEDV或Vero细胞适应株对胰酶的抵抗力不一致，有的病毒经过高代次传代培养后已不具备胰酶依赖性。研究发现，胰蛋白酶通过将S蛋白切割为S1和S2亚基，使PEDV能够在体外复制[5]。胰酶识别切割S蛋白的裂解位点在S2区的890位氨基酸，裂解后的S2可以促进病毒与宿主细胞膜融合，利于病毒粒子的入侵[6]。随后，PEDV可使受感染细胞裂解，导致细胞膜空泡化和合胞体形成[7]。

适应Vero细胞的PEDV可以在不同种类的细胞系中增殖。Liu等将仔猪中分离的PEDV Ohi VBS2株在Vero CCL-81细胞中进行适应性培养，随后用该细胞适应的PEDV分别感染PK-15、猪睾丸细胞(swine testicle，ST)、人肝癌细胞(human hepatocellular carcinomas，Huh-7)、人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblasts，MRC-5)、Vero CCL-81和蝙蝠肺细胞(bat lung，Tb1-Lu)等，结果发现Vero CCL-81细胞适应的PEDV可以感染上述细胞系，提示PEDV能够感染猪源、猴源、人源及蝙蝠源的细胞系[8]。结合基因组进化分析结果，推测PEDV可能来源于蝙蝠并且对包括人在内的其他物种都有潜在的感染能力[8]。为探索新的培养方法，研究人员利用仔猪小肠上皮细胞(intestinal epithelial cell，IEC)成功分离了PEDV流行株，通过与Vero细胞对比发现病毒在添加胰酶的IEC上适应细胞能力更强，并可以稳定传代[9]。推测可能是由于仔猪小肠上皮细胞是PEDV感染的宿主细胞，含有大量PEDV结合受体，例如pAPN等[10]。此外，IEC上的小肠宿主蛋白酶，可能具有类似胰酶的特性，可以促进病毒的侵入和增殖，提高PEDV体外培养的适应性。

2 PEDV的受体

病毒通过吸附、侵入、脱壳、合成、装配、释放等环节完成增殖，病毒黏附到细胞膜上是侵入宿主细胞的第一步，一般是与细胞表面的特异性受体结合。冠状病毒的受体包括多糖类受体和蛋白多肽类受体，其中多糖类受体又包括硫酸乙酰肝素和唾液酸。唾液酸有神经氨酸 Neu5Gc、Neu5Ac、Neu5、9Ac2等；蛋白多肽受体有氨基肽酶N (aminopeptidase N，APN)、血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)、癌胚抗原相关细胞黏附分子-1(carcinoembryonic antigen-associated adhesion molecule 1， CEACAM1)和二肽酰肽酶4(dipetidyl peptidase 4，DPP4)等[11]。研究发现，APN可能是PEDV的功能受体[8,10]，而Neu5Ac作为辅助受体发挥作用[8]。

氨基肽酶N(APN)是一种海马型锌-氨基肽酶，具有锌离子依赖性，以头对头的同源二聚体形式锚定于细胞表面。APN的活性位点和肽结合通道位于一宽开口的腔中，空腔可能会进一步开放，以结合暴露的蛋白质N末端。活性位点锚定在肽/蛋白质的N-末端中性残基，并且肽结合通道以不依赖序列的方式结合其余的肽/蛋白质。APN暴露的外表面可与冠状病毒结合，但不会影响其生理功能，从而充当冠状病毒受体。哺乳动物的APN多表达于肠上皮或神经系统等组织的细胞表面，是一种具有多种功能的二聚体细胞表面胞外酶。

关于猪源APN(porcine aminopeptidase N，pAPN)是否为PEDV的受体，一直存在争议。Li B X等[10]利用PEDV分别感染非易感细胞犬肾细胞(Madin-Daby canine kidney cells，MDCK)和过表达pAPN的MDCK细胞，发现PEDV能够在pAPN过表达的MDCK细胞生长，初步确定pAPN为PEDV的功能性受体。此外，通过建立表达pAPN的转基因小鼠模型，发现其对PEDV易感，进一步证明pAPN为PEDV的受体[12]。但是PEDV无法在天然表达pAPN的ST细胞中复制，而后者却对TGEV非常敏感。因此，有人推测认为，pAPN表达水平与PEDV感染之间可能存在相关性。进一步研究表明，pAPN受体密度似乎是导致PEDV感染成功的重要因素[13]。Liu C等[8]利用PEDV S蛋白假病毒系统发现，该假病毒能感染表达人源APN(hAPN)或pAPN的非易感细胞MDCK，表明PEDV与APN的相互作用不具有物种特异性。而且，PEDV能感染猪、猴、人、蝙蝠等物种的细胞系[8]，也进一步表明PEDV与APN的相互作用并不是特异的，提示PEDV可以跨物种传播。

近年研究发现，hAPN和pAPN可能不是PEDV的主要功能受体，APN可能通过其蛋白酶活性促进PEDV感染，但PEDV感染猪小肠上皮细胞可能与pAPN不相关[7,14]。另外，PEDV可以感染Vero细胞，但Vero细胞上的PEDV受体需要进一步确认。Ji C M等利用CRISPR/Cas9技术敲除Vero细胞的APN基因后，发现APN敲除的细胞系与正常的Vero细胞感染效率相同，而且构建的稳定表达绿猴APN的Vero细胞系感染PEDV的效率也未见增加，表明Vero细胞上可能存在其他类型的PEDV受体[7]。使用肝素作为竞争剂，发现肝素预处理PEDV时，可有效地抑制PEDV感染Vero细胞的效果，推测硫酸乙酰肝素可能是PEDV感染Vero的黏附因子，也可能是Vero细胞对PEDV易感的原因之一。此外，Vero细胞本身是干扰素缺陷型细胞且具有抗高浓度胰酶的特性，也可能是PEDV易感的另一个原因，这也进一步提示pAPN不是PEDV的唯一受体。因此，PEDV可能通过不同受体感染宿主细胞。

唾液酸是带负电荷单糖，普遍存在于细胞膜表面，唾液酸有很多病毒结合糖蛋白和糖脂的唾液酸寡糖，由于细胞外表面上糖链中唾液酸分子的介导使病毒进入细胞。除了APN，有研究表明PEDV S1的N末端具有唾液酸结合活性，S1 NTD与细胞表面的唾液酸结合能增强病毒的感染性[15]。通过聚糖阵列筛选，发现Neu5Ac与PEDV S1的结合亲和力最高[16]。然而，尚不知道唾液酸与S蛋白的结合如何影响PEDV进入细胞。

3 PEDV入胞方式

多数病毒的表面蛋白能够特异性地识别和结合细胞膜表面的受体，进而介导病毒的入胞[11]。有囊膜的病毒能直接与细胞膜发生膜融合，进而将病毒基因组释放到宿主细胞质中；多数囊膜病毒是通过宿主细胞的内吞作用，将病毒颗粒包裹在内吞小体中并进入细胞。在内吞小体中，病毒囊膜与内吞小体的膜结构在蛋白酶和低pH环境下发生病毒囊膜-内体膜融合，使病毒基因组释放到宿主细胞质中。病毒利用的内吞途径包括网格蛋白介导的内吞、小窝蛋白介导的内吞、脂筏介导的内吞和巨胞饮作用等。

2014年，Park J E等[17]利用化学抑制剂和共聚焦方法分析了PEDV侵入Vero细胞的机制，发现PEDV的入胞过程是在网格蛋白介导的内吞作用之后发生的，并且依赖于低pH才能成功进入细胞。Wei X N等[18]用不同的PEDV亚型(PEDV GⅠ亚型GDS09株和GⅡ亚型GDS01株)分别感染Vero和IPEC-J2细胞，发现PEDV可以通过网格蛋白介导的内吞、小窝蛋白介导的内吞和脂筏介导的内吞途径进入Vero和IPEC-J2细胞，而且不同亚型PEDV的侵入效率因内吞途径不同而不同。进一步分析发现，不同PEDV亚型之间的差异可能是由于S基因的差异，尤其是S基因的S1区(同源性约为92 %)与受体结合效率的不同而导致细胞进入和膜融合效率的不同[19]，提示PEDV的刺突蛋白在介导不同方式的内吞途径中各有重要作用。进一步研究发现，PEDV主要通过内吞途径进入内吞小体，在低pH环境和组织蛋白酶L的水解作用下引发病毒表面蛋白构象的改变，从而发生病毒囊膜-内体膜融合以及病毒脱衣壳，释放病毒基因组进入细胞质[19]。

关于PEDV侵入细胞的途径，就目前研究结果来看，可能与猪德尔塔冠状病毒的入侵方式类似[20]。一是内吞途径，通过宿主细胞的内吞作用，将病毒颗粒包裹在内吞小体中并进入细胞。在内吞小体中，病毒囊膜与内吞小体的膜结构在组织蛋白酶L、低pH环境下进行融合，使病毒基因组释放到宿主细胞质中[19]。二是膜融合途径，通过外源蛋白酶或宿主蛋白酶在病毒和受体结合后激活S蛋白，然后病毒通过膜融合方式进入细胞质中。

4 蛋白酶在PEDV感染中的作用

蛋白酶在病毒感染中起关键作用，不同的病毒与不同的蛋白酶相互作用从而进入细胞，这在某种程度上决定了病毒的侵入途径。一般来说，主要有4种细胞蛋白酶参与冠状病毒的感染过程。

4.1 膜结合蛋白酶

大量研究表明，跨膜丝氨酸蛋白酶在病毒与细胞受体结合后介导病毒侵入。丝氨酸蛋白酶可以激活很多呼吸道冠状病毒的感染过程。Shirato K等发现跨膜丝氨酸蛋白酶2(transmembrane protease serine 2，TMPRSS2)可以显著促进PEDV在稳定表达TMPRSS2的Vero细胞中释放病毒粒子[21]。Shi W等[22]通过对Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶家族的TMPSS2、鳞癌细胞差异表达蛋白酶1(differentially expressed squamous cell carcinoma gene 1，DESC1)、呼吸道胰酶样蛋白酶(human airway trypsin-like protease，HAT)和镶嵌式长型丝氨酸蛋白酶(mosaic serine protease large-form，MSPL)蛋白酶进行分析，结果发现TMPSS2和MSPL可与PEDV S蛋白进行共定位，且这些蛋白酶可以裂解S蛋白、促进病毒与细胞的融合。Shi等分别建立了稳定表达TMPRSS2和MSPL的Vero/TMPRSS2和Vero/MSPL细胞系，结果发现这两种细胞系(尤其是Vero/MSPL)可以代替外源胰蛋白酶用于体外培养PEDV，它们通过激活PEDV S蛋白可以显著提高病毒滴度，促进病毒-细胞之间的融合[23]。

4.2 组织蛋白酶

病毒与细胞融合进入内吞体后，溶酶体组织蛋白酶L或组织蛋白酶B即可激活病毒侵入。组织蛋白酶对SARS-CoV-2、MERS、HCoV-229E、SARS等冠状病毒均有激活作用[24-26]。利用PEDV S蛋白假病毒系统发现，PEDV侵入细胞并不依赖于前蛋白转化酶或细胞表面蛋白酶，而是被溶酶体半胱氨酸蛋白酶(组织蛋白酶L和组织蛋白酶B)激活从而裂解S蛋白，促进S蛋白包装的假病毒粒子侵入宿主细胞[27]。同时，组织蛋白酶激活PEDV侵入的效果优于胰蛋白酶，而当组织蛋白酶被抑制或缺少时，胰蛋白酶则可以替代组织蛋白酶的作用，激活PEDV侵入[27]。

4.3 细胞外蛋白酶

胰蛋白酶是一种消化酶，主要分布在小肠中，可直接裂解许多肠道冠状病毒的S蛋白，因此，对PEDV侵入具有一定的促进作用。研究发现，大多数PEDV毒株都高度依赖胰蛋白酶。当病毒与其受体结合时，胰蛋白酶可切割结合的PEDV S蛋白，而游离病毒颗粒不会被裂解[28]。这些发现表明，PEDV S蛋白在与受体结合并被外源胰蛋白酶切割后可能发生构象变化，从而诱导膜融合[28]。有研究表明，胰蛋白酶识别S蛋白的裂解位点为S2区的890位氨基酸，S蛋白的裂解可以促进病毒与宿主细胞膜融合，利于病毒粒子的入侵[6]。但是一些PEDV的Vero细胞适应株在感染细胞时并不需要胰蛋白酶，而病毒出芽阶段经胰蛋白酶处理可在感染的细胞中引起明显的细胞病变作用，导致感染的Vero细胞形成合胞体，在此过程中胰蛋白酶可以增强其感染性和CPE的形成[28-30]。

4.4 前蛋白转化酶

弗林蛋白酶(Furin)是一种前蛋白转化酶，位于反式高尔基体网络(Trans Golgi Network，TGN)中，也存在于细胞表面。弗林蛋白酶可以裂解具有特定基序的前体蛋白，以产生具有生物学活性的成熟蛋白。该酶可以在PEDV的S1/S2位点上切割S蛋白，这种切割对于S蛋白介导的细胞-细胞融合和宿主细胞入侵至关重要。研究人员通过将PEDV S蛋白中的第888位氨基酸(V888)突变为弗林蛋白酶识别的裂解位点(VQKR→RQKR)，构建融合肽N端带有弗林蛋白酶切割位点的重组PEDV毒株PEDV-SFCS，结果发现PEDV-SFCS可在培养细胞中复制，且不依赖胰蛋白酶，但是重组病毒的滴度较低[31]。表明宿主蛋白酶可能具有替代胰蛋白酶的潜力，如果能合理利用可以使得PEDV体外培养无需胰蛋白酶。

5 展望

PEDV刺突蛋白S决定了病毒的多样性和宿主嗜性，并介导病毒与宿主细胞的表面特异性受体结合和病毒-细胞膜融合过程；S蛋白还与PEDV的体外生长适应情况和体内毒力衰减有关。随着PEDV突变株的不断产生，PEDV的入胞过程可能进化出多种机制，而且PEDV可能对包括人类在内的其他物种构成潜在威胁。值得注意的是，PEDV进入宿主细胞的途径可能与所使用的细胞系和环境条件也有一定关联，因此，利用猪肠小体建立的PEDV感染模型有可能会更好的模拟PEDV体内感染的过程[32-33]，而如何提高PEDV体外培养对细胞的适应性，进而提高病毒滴度，是研究者们关注和急需解决的重要问题之一。因此，构建不依赖于胰蛋白酶的通用的PEDV细胞系，对于PEDV的分离培养、病毒生物学研究，防御病毒感染至关重要。对于PEDV S蛋白与pAPN受体的深入研究将有助于更好地了解病毒入胞机制。PEDV入胞机制的深入研究，也将为靶向入胞途径的抗病毒药物设计提供靶点，并为PEDV的防控提供了新的思路和方向。