猪圆环病毒2型衣壳蛋白体外表达研究现状

王爱静，和彦良，宋 妮，由海波，孟庆森，陈超阳，李真光,2*

(1.华威特(江苏)生物制药有限公司，江苏泰州 225300；2.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009)

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)是目前已知的最小DNA病毒之一，属于圆环病毒科圆环病毒属病毒[1]，该病毒在世界范围内广泛分布。目前，已发现3种类型的猪圆环病毒，包括猪圆环病毒1型(Porcine circovirus type 1,PCV1)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)和猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)。1974年，发现PCV1能够感染猪肾细胞系(PK-15)，但由于患病猪自身可以对该病毒产生抗体，所以认为该病毒是非致病性的病毒[2]。至1991年，在加拿大首次从断奶仔猪中分离到PCV2，其感染后可引起仔猪断奶多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)、先天性震颤(Congenital tremors,CT)、猪皮炎肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory disease complex,PRDC)、繁殖障碍等多种疾病，统称为猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associated disease,PCVAD)[3]。2000年，郎洪武等[4]首次在我国发现并报道PCV2的存在，随即多个地区出现了PCV2的相关报道，感染率和发病率逐渐升高，流行情况也呈上升趋势，严重制约了我国养猪业的发展，然而迄今尚未有相关报道阐明PCVAD确切的致病机制。PCV3是2016年在美国新发现的一种病毒，临床症状表现为猪皮炎肾病综合征(PDNS)和多器官炎症等，近年已在美国、意大利、中国和波兰[5]分离到该病毒。

1 PCV2的概述

PCV2是影响养猪业最重要的病原体之一，特别是在亚洲国家，不同日龄及性别均会感染该病毒，以哺乳期和断奶仔猪最易感，特别是5周龄～12周龄仔猪；患病猪会出现体重减轻、淋巴结肿大、腹泻、黄疸、呼吸窘迫等临床症状[6]。PCV2感染能够破坏易感动物的免疫系统，造成免疫抑制，导致机体抵抗力下降，从而诱发多种病毒或细菌的混合感染或继发感染，给疾病的诊断和治疗带来极大的困难[7]。PCV2的感染与传播途径很多，如可以通过被感染动物的排泄物以及呼吸、唾液等进行传播，怀孕母猪感染PCV2后可通过胎盘垂直传播感染仔猪；研究发现，公猪人工成功感染PCV2后，在其精液中可检测到PCV2的DNA；鸟类、啮齿动物也可以携带并传播病毒，因此该病毒的广泛传播途径加大了防控的难度，疫苗防控成为了不二之选。通过对世界各地不同PCV2的序列分析显示，核苷酸序列同源性可达93%，核苷酸多样性为3.5%[8]，目前其基因可分为5大基因型，分别是PCV 2a、PCV 2b、PCV 2c、PCV 2d、PCV 2e。中国目前存在的基因型有PCV 2a、PCV 2b、PCV 2d、PCV 2e以及其他未确认的基因型,并存在2个及2个以上基因型交叉感染的情况[9]。

PCV2是20面体对称的单链环状DNA病毒，病毒粒子直径约为17 nm[10]，由1 767个～1 768个核苷酸组成，编码11个开放阅读框(open reading frame,ORF)，其主要2个开放性阅读框为ORF1(945个氨基酸，位置在51-995位)、ORF2(702个～705个氨基酸，位置在1 030/1033/1034至1734/1735位，是编码参与病毒复制(自我复制)的酶蛋白、免疫原性衣壳蛋白和病毒致病相关蛋白[11]。由PCV2 ORF2编码的衣壳蛋白(Cap蛋白)是病毒唯一结构蛋白，也是病毒主要的免疫原性蛋白，基因长度为702 bp,分子质量约为27.8 ku[12]，能够刺激机体产生特异性中和抗体。在PCV1毒株和PCV2毒株的进化分析上，由于ORF2基因较短且在两个毒株之间存在明显的差异，因此该基因常被用作区别两个毒株的主要分子标识。此外，Cap蛋白存在多态性，在PCV2病毒吸附过程中起重要作用，同时在装配动力学和结构稳定性上对PCV2也有一定的影响[13]。不仅如此，Cap蛋白上拥有PCV2的主要保护性抗原表位，可以刺激机体产生免疫应答，因此是基因工程疫苗研发的理想抗原。本文对Cap蛋白的体外表达以及相关疫苗研制进行了阐述，以期为新型疫苗的研发提供参考。

2 Cap蛋白表达系统

2.1 大肠埃希氏菌原核表达系统

大肠埃希氏菌表达系统是用于表达重组蛋白的一种技术，由于其具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和诱导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模生产等优点被广泛应用。大肠埃希氏菌原核表达系统可以直接表达外源蛋白，分为可溶性和不可溶性(包涵体)蛋白2种表达形式，为了后续处理使用方便，大多数都倾向于蛋白的可溶性表达[14]。然而，ORF2基因核定位信号(nuclear localization signal，NLS)上稀有密码子的5′端能够导致新生多肽链过早终止，从而阻碍Cap蛋白的产生。对此，Marcekova等在ORF2两端附加一个聚组氨酸标签，并将基因进行截短优化以及人为加入启动子，来提高Cap蛋白在大肠埃希氏菌中的可溶性表达。然而，表达的蛋白不能够自组装成为病毒样颗粒(virus-like particles，VLP)[15]。Wu P C等[16]将一个全长的ORF2基因在5′端附近优化4个密码子，优化后的ORF2基因编码的Cap蛋白能够自组装成VLPs，在大肠埃希氏菌表达系统成功表达。

研究表明，一些可溶性较高的蛋白质与包涵体蛋白融合后，可促进包涵体蛋白以可溶性形式表达或提高可溶性蛋白的稳定性，如利用多聚组氨酸标签、谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase，GST)等具有标签的融合蛋白，通过聚合酶链反应与目的基因进行融合，通过诱导表达提高目的蛋白的可溶性。此外，插入的标签蛋白因其具有标记性，为目的蛋白进一步纯化、浓缩和检测提供了保障，同时也提高了目的蛋白的稳定性[17]。然而，有的标签存在于目的蛋白上会影响试验结果，所以Wu P C等[16]使用上述优化后的PCV2 ORF2核苷酸序列和含有His标签的pET24a(+)表达系统进行融合后，使用聚合酶链反应从pET24a(+)载体中剔除了T7和His标签序列，在大肠埃希氏菌中成功表达了不含融合标签的Cap蛋白，经检验蛋白多以可溶性的形势存在于上清中且具有良好的免疫原性，为制备PCV2亚单位疫苗尤其是病毒颗粒样(VLP)疫苗奠定了基础。目前，国内已上市的商品化PCV2亚单位疫苗大多是采用大肠埃希氏菌表达系统诱导表达的Cap蛋白为靶蛋白，经与相应佐剂混合乳化后制成，如易邦生物科技有限公司和普莱柯生物工程股份有限公司研制的PCV2基因工程亚单位疫苗。该表达系统表达蛋白成本低，能够稳定表达，易纯化获得，但表达形式的不确定性以及目的蛋白上存在标签增加了进一步试验难度。

2.2 酵母菌表达系统

酵母菌表达系统的优点在于表达量高、能够完整的表达分泌外源蛋白并可对外源蛋白进行加工修饰、表达的蛋白质不含有内毒素、易于纯化、可以实现大规模生产、能够广泛用于工业及医药生产，是仅次于大肠埃希氏菌的表达系统[18]。目前，最常用的两种酵母菌表达菌株有毕赤酵母和酿酒酵母。最早用于工业及医药生产的酿酒酵母，因其不能在生产中高密度发酵，所以主要作为益生菌来使用；而毕赤酵母克服了该缺点，不仅能够进行大规模发酵，而且产量高。最主要的优势是可以分泌大分子的外源蛋白，而且能够稳定表达不被截断，因此受到广泛的关注。

谢景毅[19]将优化密码子后的PCV2 ORF2基因插入pPICZα A表达载体中，转化毕赤酵母X-33宿主，筛选获得高效表达的菌株，经发酵罐中进行高密度发酵，发现在发酵液上清中PCV2 Cap蛋白的产量达到总蛋白定量比例的23.5%。在仔猪模型上进行了以PCV2 Cap蛋白为抗原的体内免疫试验，结果表明，PCV2 Cap蛋白能够在毕赤酵母中分泌表达且具有良好的免疫原性，其核定位信号的缺失不影响PCV2 Cap蛋白的免疫性能。高田[20]利用酿酒酵母的不同表达元件构建了多种重组表达载体，获得了能够分泌表达重组PCV2 Cap蛋白的酿酒酵母菌株；通过该菌株表达制备的PCV2 VLP经验证具有良好的免疫原性。酿酒酵母表达VLP能够激发机体黏膜免疫，相对安全性较高，具有口服免疫的优势，为潜在新型PCV2亚单位口服疫苗的研制奠定了基础。

2.3 乳酸菌表达系统

乳酸菌在自然界中分布广泛，可黏附在人和动物体内黏膜表面，如口腔黏膜、消化道黏膜等，在食物、土壤和水体中也有存在。以乳酸菌作为基因工程受体菌表达外源蛋白有显著的优势。首先，乳酸菌作为益生菌，不会对人体产生致病性；其次，遗传背景清晰且抗原性较弱，乳酸菌中Usp45蛋白是目前已知唯一可检测出的自身分泌蛋白，避免了微生物自身蛋白对外源蛋白表达的干扰；再者，通过构建的重组植物乳杆菌，能够作用于机体黏膜，产生黏膜免疫，刺激机体产生特异性反应[21]，而且通过口服的形式给药，在操作上比注射给药简便。最近的20年间，以乳酸菌作为载体携带预防或治疗药物得到了广泛的重视。

Wang L等[22]利用乳酸菌表达的PCV2 Cap蛋白制备口服型PCV2活载体疫苗，通过模拟肠道环境以及口服途径免疫小鼠进行试验，结果表明，超过90%的乳酸杆菌能够在模拟的肠道环境中存活，小鼠口服后能够产生PCV2特异性抗体且小鼠肠道中能够存活至少11 d。孙博[23]将构建的pAMJ399-Cap重组质粒转入乳酸乳球菌感受态细胞中，经诱导获得可溶性表达的Cap蛋白，并通过建立小鼠模型，口服免疫进行观察，结果显示，免疫组小鼠sIgA和IgG水平均高于对照组，且IL-4和IFN-γ两种细胞因子呈明显升高趋势，表明构建的重组乳酸乳球菌可稳定表达PCV2 Cap蛋白，不仅可以诱导机体产生细胞免疫应答，也可以产生体液免疫应答，并具有良好的安全性。乳酸杆菌表达系统与酵母菌表达系统类似，均能够口服刺激黏膜免疫，与其他表达系统相比，免疫途径难度相对较低，且安全有效，但口服后，由于肠胃环境特殊可能会影响免疫时间。

2.4 病毒载体表达系统

目前已有许多国内外学者通过应用病毒活载体体外表达系统对PCV2 Cap蛋白进行研究，该表达系统具有宿主范围广、表达外源基因效率高等特点。其中以腺病毒、杆状病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒以及猪瘟病毒等的研究相对较多，且取得了许多突破性进展。

2.4.1 杆状病毒表达系统 昆虫杆状病毒表达系统在哺乳动物细胞中无法复制，所以不会感染人和动物，具有良好的生物安全性且种属特异性较高。杆状病毒表达系统属于真核表达系统，可对在表达哺乳动物、禽类等外源蛋白时出现的糖基化、甲基化做进一步翻译后修饰，更充分的暴露出病毒的抗原决定簇等结构，使得被免疫动物体内产生相应的特异性抗体[24],达到预防及保护作用。目前，昆虫杆状病毒表达系统在PCV2疫苗研制和生产中得到了应用，如勃林格殷格翰动物保健公司的PCV2疫苗和英特威先灵葆雅动物保健公司的PCV2疫苗，均以杆状病毒表达系统表达的Cap蛋白作为疫苗抗原，制备的疫苗有效降低仔猪体内的病毒含量，减少淋巴组织的损伤，降低死亡率，实现了对动物的保护作用[25-26]。

朱鹏等[27]将优化后的PCV2 ORF2基因克隆到杆状病毒转移载体中，并将该重组质粒转染至sf9细胞，得到含有PCV2 ORF2基因的重组杆状病毒，通过培养感染杆状病毒的sf9细胞获得其表达分泌的重组蛋白；对该重组蛋白进行验证并作为抗原对小鼠进行免疫。结果显示，重组蛋白能刺激小鼠机体产生特异性抗体，具有较好的免疫原性，该试验为杆状病毒表达系统表达Cap的亚单位疫苗的研制提供依据。此外，除昆虫细胞外，一些试验利用家蚕杆状病毒表达载体系统(silkworm-BEVS)表达了重组Cap蛋白，并建立了从蛹中纯化重组Cap蛋白的简单3步法，即洗涤剂萃取、硫酸铵沉淀和阴离子交换柱层析。排阻色谱法分析和电镜观察表明，纯化的重组Cap蛋白形成了与原始病毒相似的VLP。此外，利用家蚕产生的VLP免疫小鼠后产生抗PCV2的特异性抗体[28]。该研究结果表明，家蚕系统是生产PCV2 VLPs的一种方式，并将有希望开发一种可靠和经济有效的PCV2疫苗。

2.4.2 腺病毒表达载体 腺病毒表达载体现已广泛用于学术研究、制药、基因工程疫苗研发等，其优势在于宿主范围广、能够将各种外源基因转移到不同靶细胞或组织中且转导效率较高，以及表达的外源蛋白易于制备和纯化[29-30]。李德龙[31]通过优化ORF2基因，将2种基因调控元件克隆到腺病毒载体，构建重组腺病毒载体，该试验提高了重组Cap蛋白的表达量，减少抗原免疫剂量，而且重组腺病毒载体疫苗的免疫效果也有所提高，为猪群PCV2感染防控奠定了基础。许晗等[32]在pAdShttle-CMV载体中插入PCV2 ORF2和耶尔森氏菌侵袭素C端(InvC)两个基因序列，构建的重组穿梭载体并与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组获得重组腺病毒质粒，将重组质粒转染至HEK293细胞，经培养并检验感染重组腺病毒的HEK239细胞，结果表明，重组腺病毒能够表达PCV2 Cap蛋白和InvC，其TCID50可达10-9.32，该试验为PCV2重组腺病毒活载体疫苗的研发提供了基础条件。

2.4.3 伪狂犬病病毒表达系统 以伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)为载体的活疫苗优点较多：具有多个可供外源基因插入的位点；由于免疫期较长，可持续表达外源基因；该病毒载体具有较强的复制能力，能够大量表达外源蛋白且安全性较高，因此受到国内外学者的广泛关注。Chi J N等[33]使用同源重组技术将PCV2 ORF2基因插入PRV中并将PRV gE上游基因进行替换，使用免疫荧光和Western blot分析表明在病毒复制过程中表达分泌了Cap蛋白，且经电子显微镜观察表明Cap蛋白自组装成VLPs。用纯化后的VLP作为抗原免疫小鼠可诱导其产生明显的特异性反应。结果表明，基于重组PRV表达分泌的VLP可以作为亚单位疫苗的候选。目前，猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2蛋白、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)VP2蛋白、猪圆环病毒2型Cap蛋白和猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5蛋白都以PRV为载体成功表达，为各病毒的单苗及联苗的制备奠定基础。在临床上，PCV2、PRV、PPV经常伴有混合感染，因此，郑晓辉等[34]将PPV VP2基因和PCV2 ORF2基因通过与口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV) 2A蛋白连接，应用连接后的整段基因替换PRV gE基因构建重组PRV载体，该重组病毒能够在BHK-21细胞中表达分泌PPV VP2蛋白及PCV2 Cap蛋白，该试验对生产实践具有重要的指导意义。

3 小结

PCVAD作为一种猪源多发性传染病，在世界范围内广泛传播，给养猪业造成了严重的经济损失，其传播途径多种多样，不仅不同基因型之间交叉感染，而且还会与其他病原菌之间出现并发或继发感染。所以该病的预防和防控受到了世界各国的广泛重视，并且由于PCV2基因型的不断变异，为检测和预防加大了难度。Cap蛋白是PCV2唯一的衣壳蛋白，所以，基于Cap蛋白研制的检测技术以及基因工程亚单位疫苗成为了国内外科研人员的首选，通过不同表达系统对其进行表达，如大肠埃希氏菌原核表达系统，酵母菌真核表达系统，以及病毒活载体的杆状病毒、伪狂犬病病毒表达系统等都已经获得了一定的成果，甚至在市面上已经存在相关的检测试剂盒或亚单位疫苗，但是现存的进口诊断试剂及疫苗由于价格昂贵，导致在国内并不能普及，所以研发价格低且生产工艺简单的PCV2 Cap蛋白检测试剂盒及亚单位疫苗依然迫在眉睫。