缺锌引起的氧化应激与自噬在生精障碍中的研究进展

黎远亮，刘好鹏，易江南，张辉，唐兆新，李 英*

(1.华南农业大学兽医学院，广东广州 510642； 2.广东众宠生物科技有限公司，广东广州 510650)

生精是发生在动物睾丸当中的复杂生理过程，环境、饮食以及药物会改变睾丸的生精过程。生精不仅需要睾丸功能正常，还要受下丘脑和垂体的激素调控[1]。生精过程是快速的细胞分裂过程，也就意味着高速率的耗氧，维持睾丸稳态以及不受氧化应激损害才能保证生精正常。锌作为小分子抗氧化剂保护睾丸免受氧化损伤，锌是自由基清除酶的核心成分，同时也是巯基保护基，还被认为其可以通过从催化部位置换铁和铜等过渡金属来阻止脂质过氧化，对睾丸的氧化应激水平具有较大影响[2]。在雄性动物生殖系统中，锌是维持生殖细胞、促进精子发生必不可少的微量元素[3]。锌可作为激素平衡剂，对于维持睾丸激素水平、前列腺和性健康具有重要意义[4]。

锌是微生物、动物和植物生命活动过程中的重要元素，是300多种酶的辅酶因子，其作为各种酶的组成部分，在维持蛋白质结构完整和调节基因表达中起重要作用[5]。锌分布于脊椎动物的各个脏器中，疾病、饮食习惯等因素(如低动物蛋白饮食习惯、胃肠道疾病等)会引起机体不同程度的缺锌[6]。在可承受范围内，机体可通过自噬维持机体锌稳态，一旦超过可控范围，会导致生精障碍，伴随睾丸激素生成减少、氧化应激和细胞凋亡[7-8]。本文对缺锌引起的氧化应激和细胞自噬在生精障碍中的作用的最新研究进展进行综述，以期为后续研究提供理论基础。

1 锌在生精过程中的作用

生精过程在动物生殖系统完成，受睾丸和性激素等因素调控，锌在其中发挥着重要的作用，因为锌在雄性生精过程中调节精原细胞增殖和细胞减数分裂，并充当抗氧化剂保护睾丸免受氧化损伤[2,4,9]。锌可通过机体消化系统、循环系统进入睾丸，锌在小肠细胞通过ZIP锌转运蛋白(zinc-regulated transporters and iron-regulated transporter-like protein,ZIP)运输以及扩散运输的方式穿过质膜吸收进入血液，锌在血液循环中被分布到睾丸细胞后，在睾丸细胞发挥调控细胞增殖、形成超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)和金属硫蛋白(metallothionein,MT)等作用，其中SOD1和MT能抑制睾丸细胞的氧化应激，使睾丸细胞正常行使功能；除了从血液中转运锌进入睾丸细胞胞质，睾丸细胞的线粒体也会通过ZIP运送锌至睾丸细胞胞质；最后，睾丸细胞胞质中的锌会被ZnT (zinctransporters,ZnT)锌转运蛋白转运出细胞外[10-11]。

缺锌会影响动物生精过程，导致生精异常。有研究发现缺锌会引起睾丸组织的改变，致使圆形精子细胞脱落，其中缺锌会使睾丸组织中的FAK蛋白和TGF-β1蛋白含量明显下降[12]。缺锌增强睾丸氧化应激和炎症，导致睾丸体积减小、功能下降、睾丸细胞和生精小管变性和凋亡，进而耗竭睾丸激素，抑制精子生成[13-14]。不同生长阶段缺锌对睾丸的影响存在差异，有研究证明缺锌对青春期大鼠睾丸变性程度比晚年大鼠严重，且青春期大鼠因缺锌导致睾丸细胞凋亡会影响生殖细胞出现不可逆病变[15]。

2 氧化应激在缺锌引起的生精障碍中的作用

氧化应激是过量氧化剂或活性氧(reactive oxygen species,ROS)耗尽细胞中抗氧化剂防御机制的表现[16]。ROS是正常有氧代谢过程的副产物，ROS对于生精具有双相作用，适当水平的ROS在细胞分化和精子获能中具有生理作用；而过多的ROS则会引起睾丸氧化应激，诱导相关细胞凋亡，引发生精障碍[17]。研究发现精子核染色质浓缩期对ROS高度敏感，且此时的精子细胞缺乏DNA修复机制；此外，精原细胞中含有微量抗氧化酶，其大多数抗氧化酶会在生精过程中丢失；随着精子发生的进行，生殖细胞的SOD1活性和总超氧化物歧化酶(total superoxide disumutase,T-SOD)水平降低，导致早期生殖细胞(如精原细胞)对ROS的侵袭具有高耐受性，而晚期生殖细胞(如精子)容易受ROS侵袭，引起细胞损伤[18-19]。

研究证明，氧化应激与缺锌引发的生精障碍有着重要关联，机体缺乏锌导致血液中的丙二醛(malondialdehyde,MDA)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量增高，而总抗氧化剂活性、SOD和维生素E(Vitamin E,Vit E)含量降低，这些指标的改变表示机体存在氧化应激和炎症反应，这些问题会引起睾丸的锌浓度下降和ROS浓度上升； ROS浓度上升引起睾丸氧化应激，导致睾丸细胞凋亡和DNA损伤，引发生精障碍；同时，睾丸锌浓度下降和氧化应激同时引起睾丸组织变性，使睾丸中的FAK、TGF-β1蛋白浓度下降，这两种蛋白对生精有潜在作用[7,12]。日粮中添加适量无机锌可改善雄鹿精液性状和抗氧化能力[20]。缺锌会使机体抗氧化能力下降和ROS水平升高，导致大鼠睾丸中蛋白质、脂质和DNA的氧化损伤。缺锌会使睾丸和附睾的蛋白表达发生变化，如储存锌的MT、MTF-1、凋亡抑制蛋白Bcl-2、氧化应激调控蛋白Keap1、Nrf2，以及谷胱甘肽过氧化物酶GPX4、GPX5的表达水平下降；NF-kB、凋亡相关蛋白(Bax和caspase-3)、控制细胞自噬、凋亡以及Keap1/Nrf2轴的Beclin-1表达水平上升，睾丸和附睾组织氧化损伤明显，自噬和凋亡增加，影响生精过程[7,14,21]。

综上所述，缺锌诱发氧化应激导致雄性生精障碍的危险因素之一。但仍有些氧化应激影响生精的机制不是很明确，若要探究其潜在的作用机制，可参考先前的试验结果设计新的试验。

3 自噬在缺锌引起的生精障碍中的作用

自噬是通过一系列途径将细胞质输送到溶酶体中进行降解的过程，饥饿或其他影响细胞稳态的因素均会诱导自噬的发生，通过循环利用非必需物质或消除有害物质来获取细胞营养。自噬包括微自噬，分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)和巨自噬[22]。在有性生殖中，巨自噬是生殖细胞发生自噬的主要类型[23]。自噬的发生受自噬信号的调控，自噬是由自噬信号ULK1/Atg1-ATG13复合物引发的，该复合物受mTOR负调节，受AMPK正调节。这样它就会对营养或能量匮乏做出反应。此外，Ⅲ类PI3K复合物需要Beclin-1，其被Bcl-2抑制；在自噬体膜伸长过程中，需要Atg5-Atg12和LC3-Ⅱ，其中LC3-Ⅱ附着在自噬体膜上；LC3-Ⅱ将通过Atg4在外膜上脱脂(这一过程受H2O2抑制)，但保留在内膜上并在溶酶体内降解；自噬体的线粒体可以通过募集Sqstm1 / p62来降解(有丝分裂中的线粒体自噬)；p62通过招募Keap1进行降解，从而使依赖Nrf-2的抗氧化剂转录；最终，自噬体与溶酶体融合，发生降解[24]。自噬在正常和非正常生理条件下，对于生精有重要作用。一方面，自噬可以降解大多数长寿的蛋白质和细胞器，以维持生精细胞的细胞内稳态，精子细胞的减数分裂和生精作用，并提高精子活力；另一方面，过度的自噬会导致蛋白质的过度消耗和细胞器的损伤，诱发细胞功能障碍，并导致精子数量减少，生精缺陷和精子活动力降低[25]。

大量研究证明自噬和生精有着重要的关联。小鼠睾丸中，Sirt1参与LC3和Atg7脱乙酰化后，脱乙酰基的LC3转移至细胞质中，与自噬效应子相互作用并启动自噬[26]。Atg7是顶体形成所必需的，脱乙酰基的Atg7激活自噬，通过调控高尔基体衍生的前体小泡向顶体转运和融合，参与了小鼠精子的顶体形成[27]。自噬核心蛋白Atg5对于雄性生育至关重要，因为其通过介导多种自噬信号诱导自噬，以维持精子发生的正常进行[28]。在精子发生过程中，自噬可通过降解细胞骨架调节剂PDLIM1来促进精细胞分化，以此调节精细胞骨架的重组[29]。敲除小鼠睾丸支持细胞的Atg5或Atg7基因会使其睾丸支持细胞自噬破坏，使睾丸支持细胞尖端外质特化结构(ES)细胞骨架调节剂PDLIM1过表达，导致细胞骨架结构紊乱和ES被破坏，使精子生成减少，产生畸形精子、运动能力低精子，最终影响精子发生[30]。在一项研究中，研究者们通过Srag转基因斑马鱼揭示了Sox9调控的自噬基因Srag可通过与Beclin-1相互作用以调节睾丸自噬[31]。自噬可调节育种裸鼹鼠的精子生成，自噬增加可使睾丸间质细胞正常分泌睾丸激素，以促进育种雄性裸鼹鼠精子的生成，相反自噬不足会减少睾丸间质细胞产生的睾丸激素，抑制非育种雄性裸鼹鼠的精子生成[32]。成年雄性欧洲野牛繁殖期间，睾丸和附睾中的自噬非常活跃[33]。山羊精子发生过程中，自噬在睾丸支持细胞中非常活跃，随着精子发生从睾丸支持细胞基底室向腔室发展，自噬更明显[34]。禽类睾丸中，LC3和Atg7在生精细胞和原代精细胞中有较强的表达，在原代精细胞和生精细胞中可以观察到发达的自噬体和多囊泡体，这表明自噬在禽类精子发生过程中是活跃的[35]。

缺锌诱导细胞自噬发生。适当的自噬与足量的锌可保护机体，维持内环境稳态，一旦平衡被打破，会导致机体组织损伤。酵母会通过抑制雷帕霉素复合物1(transducer of regulated CREB activity 1,TORC1)失活以诱导非选择性自噬，使蛋白质降解，并从中回收利用释放出来的锌[36-37]。给予急性酒精中毒小鼠缺锌饮食，会抑制乙醇诱导的自噬，促使小鼠肝脏脂肪变性，同时缺锌抑制自噬增强了乙醇诱导的细胞凋亡[38]。有研究发现，缺锌使小鼠睾丸自噬相关蛋白Bcl-2下调，而Beclin-1上调，意味着缺锌促进了小鼠睾丸自噬[7,21]。

综上所述，自噬参与了精子顶体形成、精子伸长、调节精细胞骨架重组等精子生成过程，缺锌能影响动物机体自噬发生。然而，缺锌诱导雄性生精障碍中，自噬是否参与其中等科学问题，目前尚不明确。

4 展望

目前研究表明，氧化应激和自噬在动物生精障碍发生中起到重要作用，缺锌可诱发的氧化应激和自噬发生，并明确缺锌导致动物生精障碍与氧化应激有关。然而，是否自噬参与其中鲜有报道，是通过什么途径，与氧化应激之间关系等一系列问题仍有待研究。未来探究补锌在治疗生精障碍中如何调控氧化应激和以及探究缺锌诱导的生精障碍下，生精细胞氧化应激和自噬相关蛋白、基因的表达变化，可以为揭示生精、自噬、氧化应激三者关系带来帮助。