脑原位缺血预处理通过Nrf2/HO-1信号通路减轻大鼠缺血再灌注损伤

王欢欢 王刚 仲婷婷 孙健 贺宏梅 寇文辉 宋爱霞 邹玉安 薛茜

(河北北方学院附属第一医院神经内科，河北 张家口 075000)

急性缺血性脑卒中是最常见的脑卒中类型，占我国脑卒中的69.6%～70.8%〔1，2〕，已严重危害当今社会中老年人的健康和生命，每年约有数百万人新发脑卒中。目前急性脑梗死的特异性治疗包括改善脑血循环(静脉溶栓、血管内治疗、抗血小板、抗凝、降纤、扩容等方法)、他汀及神经保护等〔3〕。其中静脉溶栓现认为有效抢救半暗带组织的时间窗为4.5 h内或6 h内〔3〕，随着DAWN或DEFUSE-3研究急性前循环大血管闭塞的时间窗被扩展到16或24 h〔4〕，但由于严格的适应证和短暂的时间窗限制，以上治疗仅适用于少数患者。因此还需要进一步了解缺血病理过程的复杂机制来开发缺血性疾病的内源性保护机制。以往研究证实，脑缺血再灌注损伤的发病机理有若干因素包括：(1)兴奋性氨基酸毒性作用；(2)Ca2+超载；(3)线粒体损伤；(4)氧化应激；(5)炎症损伤；(6)细胞凋亡等，而氧化应激损伤是脑缺血再灌注损伤的核心病理环节。目前，急性缺血性脑血管病内源性保护机制的研究受到广泛关注，通过给予组织一个低于损伤剂量的刺激如缺血、低氧等，激活机体自身的内源性保护机制，已达到减轻严重损伤所带来的伤害〔5〕。这种机制主要包括缺血预处理和后处理，而缺血预处理又包括原位缺血预处理和远隔器官缺血预处理。以往研究表明，众多的神经递质、蛋白及信号通路可能参与脑缺血预处理的过程，但其作用机制尚未完全明确〔6〕。而核因子E2相关因子(Nrf)2/血红素加氧酶(HO)-1信号通路是内源性抗氧化应激的关键调控因子之一〔7〕。本研究旨在探讨脑原位缺血预处理是否可通过调控Nrf2/HO-1信号通路，提高缺血打击的耐受能力。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 250～280 g雄性SD大鼠180只，由河北北方学院实验动物中心提供，并获得河北北方学院动物实验管理委员会批准。实验动物中心室温(24±1)℃、相对湿度(45±5)%、日光灯照射12 h明暗交替。将180只雄性SD大鼠编号并按随机数字表法分为假手术组(sham组)、 缺血再灌注组(model组)、缺血预处理组(CIPC组)，每组又分别分为术后6、12、24、48和72 h。

1.2模型制作及评价 采用Zea-Longa大脑中动脉线栓法建立大鼠模型〔8〕。大鼠水合氯醛腹腔注射全麻后，分离颈总、颈内、颈外动脉，结扎颈外动脉及颈总动脉近心端，从颈总动脉远心端将线栓送至颈内动脉(18±2)mm，2 h后抽出线栓造成再灌注损伤。CIPC组行右侧颈内动脉短暂性血流阻断10 min，3 d后，同model组方法建立模型，sham组暴露并结扎血管，不插入线栓。动物清醒后，参照longa 5级评分法筛选动物模型，选取1～3分的动物为造模成功。

1.3主要试剂 MCAO栓线(北京西浓科技有限公司)；兔抗Nrf2多克隆抗体(美国Santa Craz)；兔IgG两步法免疫组织化学检测试剂盒(博士德生物)；RNAiso Plus(宝生物工程有限公司)；Fast Quant RT Kit(with gDNase，天根生化科技有限公司)；Super Real PreMix Plus(SYBR Green，天根生化科技有限公司) 。

1.4方法

1.4.1神经功能评分 实验大鼠在术后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h进行改良Garcia J H评分，包括：自主运动、体态、前肢伸展运动、抓持和攀爬铁笼能力、两侧身体触觉反射和两侧胡须触碰反应6部分内容，功能正常时得分最高，18分。

1.4.2苏木素-伊红(HE)染色、免疫组化检测Nrf2 将脑组织制成5 μm厚的组织切片分别进行HE染色和免疫组化，光学显微镜下进行观察。

1.4.3qRT-PCR 方法检测Nrf2和HO-1 mRNA的表达量 麻醉大鼠，生理盐水进行心脏灌注，取缺血侧脑组织，在液氮中研磨充分后，按Trizol 试剂说明书提取总RNA，紫外分光光度计检验RNA 纯度，要求波长在260 nm和280 nm处吸光度比值为1.8～2.0。用 RT 逆转录试剂盒逆转录成cDNA，以cDNA为模板，建立qPCR体系20 μl，反应条件为：95℃预变性15 min，95℃变性10 s，退火60℃15 s，40个循环。以β-actin为内参照，Nrf2 上游引物：5＇-CACATCCAGACAGACACCAGT-3＇，下游引物：5＇-CTACAAATGGGAATGTCTCTGC-3＇；HO-1上游引物5＇-GAACTGTGGTCGGTAGAGGC-3＇，下游引物5＇-ATCAAAGTGGCCATGACGCT-3＇；β-actin上游引物5＇-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3＇，下游引物5＇-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3＇。

设置熔解曲线判断是否有非特异性的扩增。校正每个样品的Ct值，得ΔCt值。以2-ΔΔCt法计算各组间mRNA的表达量。ΔΔCt=各组(Ct目的基因-Ct β-actin)-对照组(Ct目的基因-Ct β-actin)，2-ΔΔCt=各组基因表达量/假手术组基因表达量〔9〕。

1.5统计学方法 采用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组大鼠不同缺血再灌注时间改良Garcia J H评分比较 model组和CIPC组在各个时间点的神经缺损评分均明显低于sham组(均P<0.01)。再灌注24 h、48 h和72 h时CIPC组的神经缺损评分明显高于model组(均P<0.05)，见表1。

2.2大鼠HE染色 sham组大鼠神经细胞大而圆，形态规则，连接紧密。model组6 h出现细胞水肿，细胞周围间隙增宽，细胞间隙出现大小不等的空泡，无明显细胞坏死；12 h时细胞明显水肿、上述症状逐渐加重；24、48 h时神经元核固缩、浓染，神经元结构明显破裂、排列紊乱，细胞核呈深染、固缩，周围出现较大空泡，细胞坏死明显；72 h时神经元水肿逐渐减轻，部分细胞出现不可逆性坏死。CIPC组各时间点较缺血再灌注组均可见神经细胞缺血性改变减轻。见图1。

表1 各组大鼠不同缺血再灌注时间改良Garcia J H评分比较分，n=6)

图1 各组大鼠脑梗死神经元形态变化(HE，×400)

2.3各组大鼠 Nrf2表达情况 sham组Nrf2表达无明显改变，在6 h时model组及CIPC组Nrf2核着色的阳性细胞开始增多，24 h达高峰，48 h开始下降。model组与CIPC组在各时间点Nrf2核阳性细胞数明显高于sham组(P<0.01)。CIPC组在各个时间点Nrf2核阳性细胞数明显高于model组(P<0.05，P<0.01)，见表2、图2。

表2 各组大鼠不同缺血再灌注时间Nrf2表达情况比较个，n=6)

2.4各组大鼠Nrf2和HO-1 mRNA表达情况 sham组Nrf2、HO-1呈低水平表达且随着时间的延长无明显变化。model组、CIPC组Nrf2、HO-1 mRNA在缺血6 h时表达开始增加，24 h时达到高峰，48 h开始下降；model组与CIPC组在各时间点Nrf2、HO-1mRNA的表达均明显高于sham组(P<0.05，P<0.01)。CIPC组在各个时间点Nrf2、HO-1 mRNA的表达均明显高于model组(P<0.05，P<0.01)。见表3。

图2 各组大鼠免疫组织化学染色(DAB，×400)

表3 各组大鼠不同缺血再灌注时间Nrf2和HO-1 mRNA表达比较

3 讨 论

缺血性脑卒中是由于脑血管阻塞导致血流供应障碍引起的脑卒中，脑细胞由于能量供应障碍引发了瀑布式级联反应导致脑细胞损伤〔10，11〕。目前关于脑缺血神经保护剂的研究众多，但结果尚存争议。其主要原因在于目前研究主要针对单一靶点的药物，这与缺血性脑损伤瀑布式级联反应过程是相悖的。因此努力探究全面的神经保护治疗方案至关重要。Correia等〔11〕研究发现冠状动脉缺血预处理可引起再发心肌梗死，但其体积减小75%。由此揭示了缺血再灌注损伤的内源性保护机制，并率先提出缺血预处理(IPC)的概念。最开始，大多数学者对IPC研究的重点在如何增强心肌对缺血的抵抗力方面，后期大部分的实验证明IPC所带来的缺血耐受是一种较普遍的现象，可在各个器官中发生，包括心脏、大脑、肾脏、视网膜等〔12〕。心肌和脑组织是相对缺血较敏感的组织，因此也是开展IPC最有希望的部位。以往研究证实，众多的神经递质、蛋白和信号通路可能参与IPC的保护作用〔13，14〕。在临床工作中，我们发现有TIA病史的患者脑卒中发病率及卒中严重程度都有所下降，这一现象为研究脑缺血预处理提供了思路。

既往研究表明，Nrf2/HO-1信号通路具有抗氧化应激损伤的重要作用〔15〕。静息状态下，Nrf2与其抑制因子 Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白(Keap)1在细胞质中耦联，处于相对抑制的状态〔16～20〕，当细胞缺血缺氧时，Nrf2与Keap1解离，Nrf2核转位并结合HO-1。 HO-1在细胞应激过程中发挥抗氧化、抗炎的作用。此外，研究证实HO-1还可作为细胞应激的保护性应答标志〔18，19～22〕。Tanaka等〔23〕发现，在脑缺血再灌注模型中，Nrf2的表达是一个动态变化的过程，Nrf2在缺血组织中2 h时表达量上升，8 h时达到高峰，24 h和72 h时表达下降。而在本研究中，脑缺血预处理也显著增加了Nrf2核转移阳性细胞的数量及Nrf2 mRNA的表达，也呈现一动态变化过程，这与上述研究是一致的。

本研究结果推测CIPC通过Nrf2/HO-1信号通路对缺血再灌注损伤发挥神经保护作用。本研究结果为缺血缺氧性脑病防治提供了新的治疗策略，有望改善病人预后。