利用LC-MS技术解析沙田柚、琯溪蜜柚种子代谢物的差异

崔学宇， 彭玉娇， 陈众峰， 李 静， 邵元元， 侯彦林， 贾书刚

(1.南宁师范大学广西地标作物大数据工程技术研究中心/北部湾环境演变与资源利用教育部重点实验室/广西地表过程与智能模拟重点实验室， 南宁 530001;2.上海欧易生物医学科技有限公司， 上海 201210)

沙田柚(Citrusmaxima(Burm.) Merr. cv. Shatian Yu.)和琯溪蜜柚(Citrusmaxima(Burm.) Merr. cv. Guanximiyou)是重要的柑橘栽培品种[1]，在我国南方广泛种植。柚子种子是柚子食用、加工的副产物，研究表明，不同组别沙田柚种子数目在58.88～119.45之间[2];在我国柑橘加工后产生的种子达三万t[3]；此外，不同柑橘种子的成分存在差异。因此对沙田柚和琯溪蜜柚种子成分进行分析比较在柚类种子的加工利用中有着重要意义。

柑橘种子油脂含量较高[4-6]。对广东省梅州市、广西区容县的沙田柚研究表明，柚籽富含亚油酸，可以作为较好的食用调和油原料[7-8]。柑橘种子还有重要的药用价值，蜜柚种子的提取物可以抑制卵巢癌细胞的增殖[9]，在蜜柚、沙田柚种子中提取的柠檬苦素具有消炎止痛的功效[10-12]。此外，柚子种子还富含其他生物活性物质[13]，在食品保鲜、生物农药等领域发挥重要的功效[14-15]。

柚类种子在油料、中药中均有一定的应用，但是其具体成分以及重要柚类品种沙田柚和琯溪蜜柚种子的成分及其差异均不清晰。

本研究利用液相色谱质谱(LC-MS)联用技术对沙田柚和琯溪蜜柚的种子进行分析，以期明确其种子主要成分和成分差异，为柚类种子生物学和柚类种子加工利用提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 样本处理

2019年9月中旬，在沙田柚、蜜柚核心产区广西区容县自良镇“沙田柚王国”取制种用蜜柚种子，2019年11月初，取制种用沙田柚种子，将其分别均匀混合后备用，容县是沙田柚的原产地，琯溪蜜柚为福建引种。

1.2 试验方法

种子百粒重为百粒种子直接称重，3次重复；种子粒长、粒宽为数10粒种子，利用游标卡尺测量，3次重复。

LC-MS非靶向代谢组测序委托上海欧易生物医学科技有限公司完成。具体操作如下：

1) 10粒种子液氮研磨后取80 mg，加入内标(L-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg·mL-1；Lyso PC 17∶0，0.01 mg·mL-1，均为甲醇配置)各20 μL和1 mL的甲醇溶液(V甲醇∶V水=7∶3)及小钢珠，然后放入研磨机。

2) 超声提取30 min。

3) 在-20 ℃条件下静置20 min。

4) 4 ℃条件下13 000 r·min-1离心10 min，取300 μL上清液挥干，然后用400 μL 甲醇溶液(V甲醇∶V水=1∶4)复溶，涡旋30 s，超声2 min，4 ℃条件下13 000 r·min-1离心10 min，0.22 μm的有机相针孔过滤器过滤，利用ACQUITY UPLC超高效液相串联AB Triple TOF 5600高分辨质谱仪组成的液质联用系统进行上机测试。

质控样本(QC)：所有样本各取等量混合作为QC样本。质谱上机过程中，每4个正式样本中插入一个QC样本，QC样本用于评价整个实验过程中系统质谱平台的稳定性。

种子形态数据利用SPSS 23进行计算；UNIFI 1.8.1.软件用于非靶向代谢组原始数据的采集；使用 The Human Metabolome Database(HMDB)和Lipidmaps(v 2.3)以及METLIN数据库对结果进行定性。

2 结果与分析

2.1 沙田柚、琯溪蜜柚种子的百粒重、粒长、粒宽性状

沙田柚种子百粒重为(19.76±0.44)g，琯溪蜜柚为(16.18±0.56)g，百粒重性状二者之间差异达极显著水平(p<0.01)；沙田柚种子粒长为(17.96±0.57)mm，琯溪蜜柚为(15.46±0.21)mm，二者之间差异达显著水平(p<0.05)；沙田柚种子粒宽为(8.27±0.58)mm，琯溪蜜柚为(7.51±0.17)mm，二者之间差异未达显著水平。

2.2 沙田柚、琯溪蜜柚种子代谢产物

本研究中合计检测出物质峰为12 415个，根据数据库比对出的代谢物数量为6 498，其中负离子为2 603，正离子为3 895。在Super Class层级对其分类发现，其中包括3 651种脂类及类脂分子，沙田柚特有88种，琯溪蜜柚特有134种；360种苯丙酸类和聚酮化合物，沙田柚特有5种，蜜柚特有12种；299种有机酸及其衍生物，沙田柚特有3种，琯溪蜜柚特有7种；297种杂环类化合物，沙田柚特有6种，琯溪蜜柚特有17种；259种有机氧化合物，沙田柚特有6种，琯溪蜜柚特有7种；71种苯环类物质，沙田柚特有5种，琯溪蜜柚特有7种；45种核苷及核苷酸类似物，沙田柚特有1种；44种有机氮化合物；37种生物碱及其衍生物，其中沙田柚特有2种，琯溪蜜柚特有1种；19种木质素类化合物；2种有机硫化合物；其余为未定义组别，沙田柚特有31种，琯溪蜜柚特有59种。

2.3 沙田柚、琯溪蜜柚种子的主成分分析(PCA)及聚类分析

沙田柚种子、琯溪蜜柚种子和QC样本的PCA分析如图1所示，61.1%的变量可以被解释，经7次循环交叉验证得到的PCA模型图，QC样本紧密聚集在一起，表明此实验稳定性和重复性较好，沙田柚种子和琯溪蜜柚种子可以被明显区分开。

表1 差异黄酮类代谢物(琯溪蜜柚、沙田柚)

对代谢物进行聚类，横纵聚类结果如图2所示。由图2可知，沙田柚和琯溪蜜柚的种子代谢物相对丰度存在显著差异，沙田柚和琯溪蜜柚的种子被划分在两个类群当中。

2.4 沙田柚、琯溪蜜柚种子差异代谢物的筛选

采用多维分析和单维分析相结合的办法，来筛选组间差异代谢产物。利用变量权重值(Variable important in projection,VIP)衡量各代谢物对各组样本分类判别的影响强度和解释能力，利用t检验验证组间差异代谢物的显著性(VIP>1，p<0.05)。经过分析后，合计得到差异代谢物853个，根据log 2(FC)值正负判断组内平均表达量，琯溪蜜柚种子中有479个代谢物表达上调，374个表达下调，筛选后的差异代谢物火山图如图3所示。

根据VIP值对差异代谢物表达量前50的代谢产物进行整理，将其表达量进行可视化分析，表达量进行层次聚类，代谢物及其聚类结果如图4所示。在Super Class层级对其分类发现，其中包括1个有机氧化合物、1个有机氮化合物、3个有机酸及其衍生物、4个聚酮类化合物、4个杂环类化合物、6个未分类化合物、31个脂类及类脂分子，因此利用沙田柚和琯溪蜜柚种子做食用调和油时，其成分可能存在差异。

2.5 差异代谢产物的代谢途径分析

利用KEGG数据库对沙田柚及琯溪蜜柚种子差异代谢物进行代谢通路富集分析。显著差异的代谢通路结果如图5所示(条柱高于蓝线表示为p<0.05，高于红线表示p<0.01)。由图5可知，累计20个代谢通路p<0.05，这20个代谢通路是：2-氧代羧酸代谢通路、苯丙素生物合成、柠檬酸循环、黄酮类生物合成、碳代谢、ABC转运蛋白、氨酰-tRNA生物合成、氨基酸的生物合成、硫苷生物合成、二羧基乙醛酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、氰胺酸代谢、色氨酸代谢、赖氨酸降解、丙酮酸代谢、C 5支链二元酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、谷胱甘肽代谢、托烷、哌啶和吡啶生物碱的生物合成、丁酸代谢，被显著富集的代谢通路主要涉及物质的合成和分解。

2.6 沙田柚、琯溪蜜柚种子中的黄酮类化合物及其在代谢中的差异

黄酮类化合物是柑橘中重要的工业用、药用物质。本研究中获得1 134个黄酮类化合物，有234个黄酮类化合物存在差异，其中20种为沙田柚特有，27种为琯溪蜜柚特有。根据VIP值判断，差异表达量前50的代谢产物中，有14个黄酮类代谢物，是在Sub Class分级中最多的物质(表1)。

黄酮类生物合成途径同样被显著富集，其中涉及7个代谢物质的差异，这7个物质中，琯溪蜜柚种子中上调的是圣草酚(Eriodictyol)、普鲁宁(柚皮素单糖苷，Prunin)、表儿茶素(Epicatechin)、柚皮苷(Naringin)、表没食子儿茶素没食子酸酯((+)-Gallocatechin)，下调的是柚皮素((-)-Naringenin)和绿原酸(Chlorogenic acid)。

3 讨 论

柑橘属植物在我国主要作鲜食用，另有部分可作为加工，在此过程中产生大量的柑橘种子多作为废渣直接排放[3]，同时在柑橘加工过程中会产生大量的种子，因此开发利用柑橘种子是提高其经济价值的重要手段[16]。孙谦等[17-18]对柑橘水果类种子的脂肪酸组成和提取方式进行了一定的研究，这些研究均证明了柑橘类水果种子中含有丰富的油脂，是榨油的良好材料。本研究也证实了这点，利用LC-MS的方法在2种柚类种子中鉴定到的6 498种代谢物中包括了3 651种脂类及类脂分子，鉴定得到物质数远超传统的提取方法，这一结果可以更好的服务柚子种子的加工利用。

柑橘黄酮在医药、食品添加剂、工业色素和化妆品行业均有应用[19-20]。不同的柑橘黄酮有不同的应用，如橙皮苷(hesperidin,Hsd)及其糖苷配基橙皮素(hesperetin,Hst)可以在生物体内起抗炎的作用[21]。本研究共获得1 134个黄酮类化合物，其中234个黄酮类化合物在琯溪蜜柚和沙田柚种子中存在差异，在差异表达量前50的代谢产物中，有14个黄酮类代谢物，同时黄酮类生物合成途径有7个差异代谢物质被富集，这一结果有助于沙田柚种子和琯溪蜜柚种子的差异利用，可为在分子水平解释黄酮类物质的生物合成提供一定的证据。

4 结 论

沙田柚种子百粒重显著大于琯溪蜜柚，粒长显著长于琯溪蜜柚，粒宽二者无显著差异。利用LC-MS手段检测出6 498个代谢物数量。在Super Class层级对其分类发现，脂类是其主要的物质，在2种种子中共检测出3 651种脂类及类脂分子，其中沙田柚特有88种，琯溪蜜柚特有134种；主成分分析(PCA)以及聚类分析发现，沙田柚种子和蜜柚种子可以被显著区分开；对差异代谢物的分析发现，二者共有853个差异代谢物，其中表达量前50的差异代谢物主要是脂类及类脂分子；对黄酮类物质进行具体分析发现，1 134个黄酮类化合物中有234个存在差异，黄酮类生物合成途径中有7个代谢物质存在差异，这7个物质可能是沙田柚种子和蜜柚种子黄酮类物质差异的原因。本研究为沙田柚、蜜柚种子的区别利用提供一定依据。