贵州生姜组培脱毒快繁体系的建立

王少铭，罗莉斯，侯颖辉，冷家归，李德文

(1.贵州省农业科学院 油料研究所，贵州 贵阳 550006； 2.贵州省农业科学院 香料研究所，贵州 贵阳 550006)

0 引言

【研究意义】姜(ZingiberoffcinaleRoscoe)为姜科多年生草本植物，又称生姜、黄姜等，在我国中部、东南至西南各省区广为栽培[1-3]。贵州是生姜主产区之一，常年种植面积2.7万hm2，优良地方品种有遵义大白姜、镇宁小黄姜、贞丰小黄姜等。近年来，随着贵州省农业结构调整和“十二大产业”的纵深发展，生姜成为助推脱贫攻坚的优势品种。在生姜主产区安顺、黔南州等地，生姜的种植面积迅速提升。然而，长期的无性繁殖导致生姜种性退化，产量、品质及抗性下降，利用脱毒快繁技术对种姜进行提纯复壮，能够降低或清除种姜有害病毒和细菌，提高生姜产量，减少农药施用量。【前人研究进展】目前省内关于生姜组培脱毒快繁技术的研究不多，已见报道的研究材料均为小黄姜，白姜的相关报道更少。【研究切入点】贞丰小黄姜是近年黔西南州的主栽地方品种，香味浓郁、品质优良；湄潭大白姜是遵义地区的主栽品种，纤维较少、质地脆嫩、辛辣味淡。贞丰、湄潭两地生姜栽培多年后出现种性退化，产量下降。目前，鲜见关于贞丰小黄姜及湄潭大白姜组培脱毒快繁的报道。【拟解决的关键问题】为解决贞丰小黄姜及湄潭大白姜品种退化的问题，以贵州省贞丰小黄姜和湄潭大白姜为材料，采用高温钝化+茎尖脱毒技术，优化生姜茎尖诱导、增殖培养条件，选择合适的育苗盘和基质，构建贵州生姜组培脱毒快繁体系，以期为贵州生姜种业的工厂化育苗提供技术支撑，为贵州生姜主产区生姜地方品种提纯复壮提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

贵州省贞丰县小黄姜(ZF)，遵义市湄潭县大白姜(MT)，试验材料均在当地主产区收集，并种植于贵州省农业科学院油料研究所试验地。

试剂：TMV检测试剂盒、CMV检测试剂盒(北京东歌博业生物科技有限公司生产)，其他试剂为植物组织培养基本试剂。

仪器：DNM-9602G型酶标仪(北京普朗新技术有限公司)、XYH-2A型解剖镜(上海永享光学仪器制造有限公司)、超净工作台(苏州净化设备有限公司)、RXZ型智能人工气候箱(宁波东南仪器有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 外植体的处理 挑选饱满、大块、肉色光亮的健康贞丰小黄姜和湄潭大白姜姜块，冲洗干净后用500倍多菌灵(80%含量)浸泡杀菌1 h，晾干后用进口泥炭土覆盖并适量浇水，28℃恒温培养，湿度维持在80%左右。待姜芽长至2～3 cm时，分批对姜芽进行高温处理，55℃处理5～8 min。

1.2.2 茎尖剥离 将高温处理过的姜芽用自来水冲洗30 min，用75%酒精消毒45 s，无菌水清洗干净，再用0.1%升汞溶液消毒8 min，无菌水清洗3～4次。在超净工作台中利用双目解剖镜剥离生姜茎尖，切除离叶原基0.1～0.2 mm的茎尖接种到诱导培养基上。

1.2.3 不同诱导培养基的考察 以茎尖分生组织诱导成苗阶段使用的培养基为诱导培养基。将茎尖接种到不同激素配比的培养基中，共9个处理，Y1～Y9处理6-BA(mg/L)与NAA(mg/L)的配比分别为1∶0.1、2∶0.1、3∶0.1、1∶0.3、2∶0.3、3∶0.3、1∶0.5、2∶0.5和3∶0.5。其中MS为基础培养基，添加3%蔗糖，0.7%琼脂，pH为5.8～6.0，于25～28℃，光照1 500～3 000 lx(14 h/d)条件下培养。于接种30 d统计茎尖膨大率，80 d调查诱导不定芽数，统计诱导率。

1.2.4 不同增殖培养基的考察 去除诱导苗叶片和根，将茎基部分别接种于不同激素配比的培养基中，共8个处理，Z1～Z8处理6-BA(mg/L)与NAA(mg/L)的配比分别为1∶0.1、3∶0.1、5∶0.1、7∶0.1、1∶0.3、3∶0.3、5∶0.3和7∶0.3。其中MS为基本培养基，添加3%蔗糖，0.7%琼脂及0.2%活性炭，pH为5.8～6.0，于25～28℃，光照1 500～3 000 lx(14 h/d)条件下培养。分别于接种20 d及50 d调查增殖及生长情况，统计增殖倍数。

1.2.5 组培苗病毒检测 采用酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒对生姜组培苗中的烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)进行检测。取诱导苗叶片1 g，按照试剂盒说明书的方法进行检测，检测波长为450 nm，每株样品3次重复。TMV和CMV的OD临界值分别为0.163和0.159。若样品OD值大于临界值为阳性，小于临界值则为阴性。

1.2.6 组培苗移栽 选用ZF脱毒组培苗作为材料，分别优化不同培养基质和不同规格育苗盘。于3月初将组培苗移栽到装有3种培养基质(营养土、蛭石∶珍珠岩=3∶1、泥炭土∶珍珠岩=5∶1)的72孔穴盘中，温室中培养25 d后统计成活率和生长情况，选择适宜的移栽基质后，将筛选到的基质分别装入3种规格的育苗盘(50孔、72孔、128孔)中，栽上组培苗在温室中培养25 d后统计成活率和生长情况。

1.2.7 组培苗定植 4月中下旬，待育苗盘中的脱毒苗具6～8片叶、长满新根后定植到隔离网室，定苗时浇透定根水，作遮阴(遮阴度50%)和未遮阴处理，40 d后统计成活率和生长情况，随机抽取50株进行统计，3次重复，统计成活率；随机取10株进行农艺性状测量，3次重复，测量指标为株高、分枝数、主茎叶片数、主茎倒3叶的叶长及叶宽，田间定植后按照生姜栽培日常管理。

1.3 数据统计与分析

试验结果采用DPS 17.10进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同诱导培养基对姜芽诱导的影响

生姜茎尖在诱导培养基上7 d左右开始膨大，30 d后趋于稳定，ZF和MT在不同的诱导培养基中膨大数差异较大。从表1可知，在接种30 d时，膨大率ZF为45%～90%，MT为59%～95%，ZF和MT诱导膨大的最佳培养基分别为Y3和Y2。茎尖膨大后继续培养，颜色由白转淡绿，后出现凸起形成姜芽，姜芽继续长成姜苗，同时在姜芽旁会形成新的姜芽。在接种80 d时，不同诱导培养基对ZF和MT的诱导率差异较大，分别为35%～81%和41%～90%，诱导率最高的培养基分别为Y3和Y2。说明NAA最适浓度为0.1 mg/L，过高的NAA含量不利于生姜茎尖的分化和诱导；而6-BA的最佳浓度为2～3 mg/L，不同品种生姜茎尖诱导所需的激素比例不同。

表1 不同诱导培养基的生姜茎尖分化情况Table 1 Ginger stem tip differentiation with different inducing media

2.2 生姜诱导苗的病毒检测

从图1可知，扣除空白对照后，TMV和CMV的阳性对照平均分别为1.731和1.487，阴性对照平均分别为0.013和0.009，均符合试验有效性要求。检测的ZF和MT共30个样品均为阴性，说明诱导苗不含TMV和CMV。样品送至北京中科光析化工技术研究所进行第三方检测，均为阴性。

图1 生姜诱导苗的TMV和CMV检测结果Fig.1 Results of TMV and CMV test on ginger induced seedling

2.3 不同增殖培养基对组培苗扩繁效率的影响

由表2可知，8种增殖培养基均能产生分蘖，但产生分蘖的数量不同，其中Z3的增殖效果最佳，在20 d时可使ZF和MT分别增殖2.5倍和2.4倍；50 d时增殖7.3倍和6.9倍。随着6-BA浓度的增加，组培苗分蘖数也越多，当6-BA浓度为5 mg/L时，增殖倍数达最大，继续增加6-BA的含量，增殖效果不明显。NAA浓度为0.1 mg/L时，组培苗的肉质根较少，增加NAA浓度肉质根增多。综合比较，ZF和MT的扩繁选择Z3(MS+6-BA 5 mg/L+NAA 0.1 mg/L)培养基，增殖培养40～50 d后进行2～3次继代，无需进行生根培养，于每年3月待组培苗株高8～10 cm或具4～6片叶时可进行移栽。

2.4 不同基质对组培苗移栽的影响

试验表明，以泥炭土和珍珠岩混合比为5∶1的组合最佳，其组培苗成活率在96%以上，新根3～5条，须根布满基质，叶片深绿；以蛭石和珍珠岩按3∶1混合的基质次之，其成活率为88%；以营养土为基质的组培苗成活率为75%，新根少，叶片黄绿色。

2.5 不同规格育苗盘对组培苗移栽的影响

试验表明，50孔、72孔和128孔3种规格的育苗盘中组培苗的成活率分别为96.7%、97.2%和98.2%，3种规格育苗盘中的姜苗长势较强，叶色深绿，植株健壮，根系发达。但考虑成本因素，选用128孔的育苗盘移栽最佳。

2.6 遮阴对组培苗定植的影响

由表3可见，遮阴处理可以极显著提高生姜组培苗的成活率，遮阴处理的成活率可达96%左右，而未遮阴成活率为83%左右；同时姜苗的长势极显著优于未遮阴，特别是遮阴处理的分枝数和主茎叶片数极显著高于未遮阴。姜苗由温室环境进入室外环境需要过度，强光照和高温容易灼伤幼嫩的姜苗，遮阴可以降低光照强度和环境温度，使姜苗慢慢适应外界的环境。定植组培苗时建议进行遮阴处理，遮阴处理2个月左右，注意夏季高温同样需进行遮阴，后续的田间操作按照生姜的日常管理即可。

表3 遮阴处理组培苗的生长情况Table 3 Growth situation of tissue culture seedlings under shading treatment

3 讨论

组培脱毒快繁技术已经广泛应用于蔬菜、果树等种苗的提纯复壮[4-5]，具有较广的应用前景。有关生姜组培脱毒及快繁的报道不断增多，应用茎尖分生组织诱导技术可以成功脱菌脱毒，并且均能诱导不定芽获得脱毒组培苗[6-8]，添加激素多为6-BA和NAA，葛胜娟[9]研究认为，添加6-BA和NAA的培养基更能够促进生姜幼芽的分化和增殖。试验表明，在诱导阶段，随着6-BA含量的增加，生姜的诱导率随之增加，6-BA含量在2～3 mg/L诱导率较高，与齐兰等[6-7]的研究结果一致；不同生姜品种分化诱导所需的激素含量有所差异，小黄姜所需6-BA的浓度较高。黄明等[10]研究表明，贵州六盘水小黄姜茎尖诱导分化最适6-BA浓度为3.5 mg/L。增殖扩繁阶段，较高的NAA浓度会导致肉质根的增多，不利于姜苗的转接和生长；随着6-BA浓度的增加，组培苗分蘖增多，当6-BA浓度为5 mg/L时，增殖倍数达最大，继续增加6-BA的含量，增殖效果不显著。在每个继代和增殖周期，组培苗均能生根，无需进行生根培养，结果与吴家丽等[7，11]一致。随着继代数增加，在培养基中添加活性炭可吸附有害的次生代谢产物。组培苗移栽的最佳基质为泥炭土与珍珠岩按5∶1进行混合，该基质疏松保水，利于姜苗的生根和生长，128孔穴盘移栽姜苗最经济实惠，既节约空间又不会阻碍姜苗的生长。田间定植时适当遮阴可显著提高姜苗的成活率，促进姜苗健康成长。

4 结论

筛选出最适诱导培养基为MS+6-BA 2～3 mg/L+NAA 0.1 mg/L，增殖培养基为MS+6-BA 5mg/L+NAA 0.1 mg/L+0.2%活性炭。建立的贵州生姜组培脱毒快繁体系，可促进生姜幼芽的分化和增殖及姜苗的健康成长。可在相应种植地区进行推广。