8种中药材水提物对兔球虫卵囊孢子化的影响

方改霞，王明月，侯凯玉，黄金绒，李冰冰*, 洪 军

(1.河南城建学院 生命科学与工程学院，河南 平顶山 467036； 2.河南省健康食品工程技术研究中心，河南 平顶山 467036)

0 引言

【研究意义】球虫病是一种体内寄生虫病，在畜牧业动物饲养中频发，造成严重经济损失，尤其在兔养殖业中为最。球虫孢子化卵囊经口被兔摄入体内[1]，经1～2 d即可发育为感染性孢子化卵囊，感染宿主；兔感染球虫，一般呈普遍性、混合性[2]等特点。目前，针对球虫病常用手段多为化学药物抑制，长期使用易产生耐药性，对动物机体造成损害[3]，且使用的所有化学药物均有耐药性记录[4]，故当前急需研发新型无毒害抗球虫药物。【前人研究进展】中草药绿色安全，长期使用不易产生耐药性，可有效提高动物机体的抗氧化水平，降低脂质过氧化，改善肠胃功能，增强动物免疫机能等[5-6]，越来越多的研究者尝试筛选能预防和控制球虫病的中草药[7-9]。刘阳等[10]在前期探索了6种中草药对球虫卵的抑制作用；张国[11]探索了4种中草药对兔球虫卵囊孢子化的影响。然而这些研究选用的中草药大多含有白头翁、青蒿等，相对缺少对其他中草药的研究。【研究切入点】目前桉叶、蛇床子、土荆皮、石榴皮、枯矾、穿心莲和苍术等8种中药材对微生物抑制作用的研究较普遍，且均具较好的杀菌效果，而涉及抗球虫卵囊孢子化作用研究较少。【拟解决的关键问题】探究桉叶、蛇床子、土荆皮、石榴皮、枯矾、(甘)川楝子、穿心莲及苍术等8种中药材的抗球虫卵囊孢子化作用，旨在筛选出对球虫病具有抑制效果的中药材，以期为中草药应用于兔球虫病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

初检感染球虫病死的幼兔盲肠内容物或兔新鲜粪便，由平顶山市郊区某兔场提供。

中药材：桉叶、蛇床子、土荆皮、石榴皮、枯矾、(甘)川楝子、穿心莲及苍术。其中桉叶购自方士居淘宝网店，其他均购自平顶山市张仲景大药房。

试剂：氯化钠(分析纯)，购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司；重铬酸钾(分析纯)，购自国药集团化学试剂有限公司。生理盐水、饱和食盐水溶液和2.5%重铬酸钾溶液均为自制。

仪器：冷冻干燥机(型号为Scientz-12N)，宁波新芝生物科技股份有限公司生产；低速台式离心机(型号为L530)，湖南湘仪离心机仪器有限公司；生化培养箱(型号为ZXSD-A1090)，上海智城分析仪器制造有限公司生产；高速离心机(型号为Centrifuge 5424)，德国艾本德有限公司生产；恒温振荡器(型号为THZ-98A)，上海一恒科学仪器有限公司生产；普通光学显微镜(型号为UB120i)，宁波舜宇仪器有限公司生产；高压蒸汽灭菌锅(型号为MJ-78A)，美国施都凯仪器设备有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 中药材提取液制备 取50 g干燥中药材用蒸馏水浸泡1 h，将其转移到电动中药锅中，加3～5倍体积的水，先武火自动煎煮15 min 2次后文火手动煎煮15 min 1次。将煎出的药剂先纱布过滤，再滤纸过滤，再抽滤1次，后冻干至粉末状，冻存于冰箱。各药材提取量分别为蛇床子5.3 g、土荆皮2.4 g、石榴皮3.4 g、枯矾50 g、(甘)川楝子4.3 g、穿心莲2.7 g及苍术9.6 g。

1.2.2 兔球虫卵囊的分离收集 对初检感染球虫病死的幼兔盲肠内容物或兔新鲜粪便采用饱和食盐水漂浮法[12-13]分离并收集球虫卵囊，置于2.5%重铬酸钾溶液中，4℃冰箱保存备用。

用血球计数板进行卵囊计数并镜检分离的卵囊情况。初步镜检判定卵囊[14]为未孢子化的艾美耳球虫。

1.2.3 8种中药材的处理浓度及时间 将8种中药材水煎提取物配制成浓度为125 mg/mL、100 mg/mL、75 mg/mL、50 mg/mL和25 mg/mL的溶液。分别对分离出的球虫卵作用2 h、4 h、16 h，检测每种中药材提取物在不同浓度下作用不同时间对球虫卵的抑/杀效果。每组试验3次重复，以生理盐水作空白对照。

1.2.4 8种中药材水提物对兔球虫卵的抑/杀效果 分别向2 mL无菌离心管中加1 mL浓度为104个/mL的卵囊液，4 000 r/min离心6 min，弃上清液，向沉淀中加1 mL药液。同时，取1 mL生理盐水作空白对照。混匀，20℃下分别培养2 h，4 h，16 h后，4 000 r/min离心6 min，弃上清液，向沉淀中加入1 mL生理盐水，4 000 r/min离心6 min，弃上清液。重复上一步2次。最后1次向沉淀中加入1 mL重铬酸钾溶液，摇匀，29℃培养48 h后，取出后镜检，计数总卵囊数和孢子化卵囊数，计算球虫卵囊孢子化率[15]。

卵囊孢子化率=孢子化卵囊数量/(孢子化卵囊数量+未孢子化卵囊数量)×100%

卵囊孢子抑制率=(试验组平均未孢子化率—对照组平均未孢子化率)/(1—对照组平均未孢子化率)×100%

1.3 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 20. 0进行统计分析，以“平均值±标准误差”表示，并进行方差分析、多重比较及不同因素间的主体间效应检验分析，主要对浓度、时间、浓度与时间3个因素进行主体间效应检验分析，

2 结果与分析

2.1 不同处理兔球虫卵的卵囊孢子化率

2.1.1 卵囊孢子化率 从表1可知，不同浓度和处理时间下，土荆皮、桉叶、穿心莲、枯矾、蛇床子、石榴皮、苍术和川楝子对兔球虫卵的卵囊孢子化率。

表1 8种中药材提取物不同处理兔球虫卵的卵囊孢子化率Table 1 Sporulation rate of rabbit coccidian oocysts treated with eight Chinese medicine extracts with different time

1) 土荆皮。兔球虫卵的卵囊孢子化率，在土荆皮浓度为25 mg/mL和125 mg/mL时，不同处理时间差异极显著，均表现为处理16 h的卵囊孢子化率最小，分别为29.22%和16.56%；在土荆皮浓度为50 mg/mL时，处理2 h与4 h间无显著差异，二者与处理16 h间差异极显著，处理16 h的卵囊孢子化率最小，为27.59%；土荆皮浓度为75 mg/mL和100 mg/mL时，处理2 h与16 h间无显著差异，但二者与处理4 h间差异极显著。当处理时间相同时(处理2 h、4 h和16 h)均表现为不同浓度间存在极显著差异，且125 mg/mL的卵囊孢子化率最小。

2) 桉叶。在桉叶浓度相同时，不同处理时间兔球虫卵的卵囊孢子化率均在处理16 h最小。桉叶浓度为25 mg/mL、50 mg/mL和 100 mg/mL时，不同处理时间间无显著差异；桉叶浓度为75 mg/mL时，处理2 h与4 h无显著差异，2 h与16 h间差异极显著，4 h与16 h间无显著差异；桉叶浓度125 mg/mL时，处理2 h与4 h、16 h间差异极显著，处理4 h与16 h间无显著差异。当桉叶处理时间相同，浓度不同时，均表现为125 mg/mL处理兔球虫卵的卵囊孢子化率最小。当处理时间为2 h时，桉叶浓度125 mg/mL、100 mg/mL与25 mg/mL、50 mg/mL、75 mg/mL间差异极显著，100 mg/mL与125 mg/mL间无显著差异。在处理时间为4 h时，桉叶浓度25 mg/mL、50 mg/mL与75 mg/mL、100 mg/mL、125 mg/mL间差异极显著，75 mg/mL与125 mg/mL间差异极显著，100 mg/mL与125 mg/mL间差异显著。在处理时间为16 h时，不同桉叶浓度间差异极显著。

3) 穿心莲。在穿心莲浓度相同时，不同处理时间兔球虫卵的卵囊孢子化率均在处理2 h最小。在穿心莲浓度为25 mg/mL时，不同处理时间间差异极显著；穿心莲浓度为50 mg/mL时，4 h、16 h与2 h间呈极显著差异，4 h与16 h间无显著差异；穿心莲浓度为75 mg/mL时，处理2 h、4 h与16 h间差异极显著，处理2 h与4 h间无显著差异；穿心莲浓度为100 mg/mL时，处理2 h与4 h、16 h间差异极显著，处理4 h与16 h间无显著差异；穿心莲浓度为125 mg/mL时，处理2 h与16 h差异极显著，处理4 h与16 h、处理2 h与4 h间差异显著。

在穿心莲处理时间相同，浓度不同时，处理2 h以125 mg/mL处理兔球虫卵的卵囊孢子化率最小，处理4 h和16 h时，均为100 mg/mL处理兔球虫卵的卵囊孢子化率最小。当处理时间为2 h，穿心莲浓度25 mg/mL、50 mg/mL、75 mg/mL与100 mg/mL、125 mg/mL间差异极显著，100 mg/mL与125 mg/mL间无显著差异。当处理时间为4 h，穿心莲浓度100 mg/mL、125 mg/mL与25 mg/mL、50 mg/mL、75 mg/mL间差异极显著，100 mg/mL与125 mg/mL间差异显著。当处理时间为16 h，穿心莲浓度100 mg/mL、125 mg/mL与25 mg/mL、50 mg/mL、75 mg/mL间差异极显著，100 mg/mL与125 mg/mL、50 mg/mL与75 mg/mL间无显著差异。

4) 枯矾。在枯矾浓度相同时，除125 mg/mL在处理2 h兔球虫卵的卵囊孢子化率最小外，其余浓度均表现为处理16 h兔球虫卵的卵囊孢子化率最小。枯矾浓度为25 mg/mL、50 mg/mL、75 mg/mL、125 mg/mL时，各处理时间间均无显著差异；枯矾浓度为100 mg/mL时，处理2 h、4 h与16 h间差异极显著，处理2 h与4 h间无显著差异。

在枯矾处理时间相同时，均表现为枯矾浓度75 mg/mL处理兔球虫卵的卵囊孢子化率最小。当处理时间为2 h与4 h时，枯矾浓度75 mg/mL与其余浓度处理间差异极显著，其余浓度处理间无显著差异；当处理时间为16 h时，枯矾浓度75 mg/mL和100 mg/mL与25 mg/mL、50 mg/mL、125 mg/mL间差异极显著，75 mg/mL与100 mg/mL间，25 mg/mL、50 mg/mL与125 mg/mL间均无显著差异。

5) 蛇床子。在蛇床子浓度相同时，除125 mg/mL在处理2 h兔球虫卵的卵囊孢子化率最小外，其余浓度均表现为处理4 h兔球虫卵的卵囊孢子化率最小。蛇床子浓度为25 mg/mL和100 mg/mL时，不同处理时间间无显著差异；蛇床子浓度为50 mg/mL时，处理4 h与2 h、16 h间差异极显著，处理2 h和16 h间无显著差异；蛇床子浓度为75 mg/mL和125 mg/mL时，不同处理时间间差异极显著。

当处理时间为2 h，蛇床子浓度为125 mg/mL处理兔球虫卵的卵囊孢子化率最小；处理时间为4 h和16 h，蛇床子浓度均为75 mg/mL处理兔球虫卵的卵囊孢子化率最小。处理时间2 h时，蛇床子浓度125 mg/mL与25 mg/mL、50 mg/mL、75 mg/mL、100 mg/mL间差异极显著；处理时间4 h时，蛇床子浓度75 mg/mL与25 mg/mL、100 mg/mL、125 mg/mL间差异极显著；处理时间16 h时，蛇床子浓度75 mg/mL与25 mg/mL、50 mg/mL、125 mg/mL间差异极显著。

6) 石榴皮。在石榴皮浓度为25 mg/mL和50 mg/mL时，均表现为处理2 h兔球虫卵的卵囊孢子化率最小，其余浓度均表现为处理4 h兔球虫卵的卵囊孢子化率最小。石榴皮浓度为25 mg/mL、50 mg/mL和100 mg/mL时，不同处理时间兔球虫卵的卵囊孢子化率差异极显著。石榴皮浓度为75 mg/mL时，处理4 h与16 h、2 h与16 h间差异极显著；石榴皮浓度为125 mg/mL时，处理4 h与2 h、2 h与16 h间差异极显著，4 h与16 h间无显著差异。相同处理时间，均以125 mg/mL处理兔球虫卵的卵囊孢子化率最小，且与其余浓度处理间差异极显著。

7) 苍术。当苍术浓度为25 mg/mL和50 mg/mL时，均表现为处理4 h兔球虫卵的卵囊孢子化率最小，其余浓度均表现为处理16 h兔球虫卵的卵囊孢子化率最小。苍术浓度为25 mg/mL，处理4 h和2 h间无显著差异，4 h和16 h、2 h和16 h间差异极显著；苍术浓度为50 mg/mL，处理4 h和2 h间差异极显著，处理4 h和16 h、2 h和16 h间无显著差异；苍术浓度为75 mg/mL和 100 mg/mL，不同处理时间间无显著差异。苍术浓度为125 mg/mL，处理2 h与16 h间差异极显著，处理2 h和4 h、4 h与16 h无显著差异。

当苍术处理时间相同，均表现为125 mg/mL处理兔球虫卵的卵囊孢子化率最小，且与其余浓度处理间差异极显著。

8) 川楝子。当川楝子浓度为25 mg/mL、100 mg/mL和125 mg/mL时，均表现为处理16 h兔球虫卵的卵囊孢子化率最小，其余浓度均表现为处理4 h兔球虫卵的卵囊孢子化率最小。川楝子浓度为25 mg/mL、75 mg/mL和100 mg/mL，不同处理时间间无显著差异；川楝子浓度为50 mg/mL，处理4 h和2 h、16 h间差异极显著，16 h和2 h间无显著差异；川楝子浓度为125 mg/mL，处理16 h与2 h、4 h间差异极显著，4 h和2 h间无显著差异。

当川楝子处理时间相同，均表现为125 mg/mL处理兔球虫卵的卵囊孢子化率最小，且与其余浓度处理间差异极显著。

2.1.2 浓度、时间、浓度与时间的主体效应 对浓度、时间、浓度与时间进行主体间效应检验结果表明，三者对石榴皮、穿心莲、土荆皮、川楝子、枯矾、蛇床子处理兔球虫卵的卵囊孢子化率影响极显著，其中对石榴皮、穿心莲处理兔球虫卵的卵囊孢子化率的影响依次为浓度>时间>浓度与时间；对土荆皮、川楝子、枯矾处理兔球虫卵的卵囊孢子化率的影响依次为浓度>浓度与时间>时间；对苍术处理兔球虫卵的卵囊孢子化率的孢子化率影响显著，依次为浓度>浓度与时间>时间；对蛇床子处理兔球虫卵的卵囊孢子化率的影响依次为浓度与时间>浓度>时间。浓度、时间对桉叶处理兔球虫卵的卵囊孢子化率影响极显著，依次为浓度>时间。

2.2 不同处理兔球虫卵的抑卵囊孢子率

由表2可知，土荆皮抑卵囊孢子率在同一时间梯度内与药液浓度呈正相关，同一浓度梯度内与药液作用时间亦呈正相关，且浓度125 mg/mL时，作用16 h后抑孢子化程度最好，抑制率达83.10%；桉叶抑卵囊孢子率在同一时间梯度内与药液浓度呈正相关，同一浓度梯度内与药液作用时间亦呈正相关，药液浓度125 mg/mL时，作用4 h后抑孢子化程度最好，抑制率为80.83%；穿心莲土荆皮抑卵囊孢子率在同一时间梯度内与药液浓度呈正相关，药液浓度125 mg/mL时，作用2 h后抑孢子化程度最好，抑制率达55.65%；枯矾药液浓度75 mg/mL时，作用4 h后抑孢子化程度最好，抑制率达53.45%；蛇床子药液浓度75 mg/mL时，作用4 h后抑孢子化程度最好，抑制率达48.29%；石榴皮同一浓度梯度内与药液作用时间呈正相关，药液浓度125 mg/mL时，作用4 h后抑孢子化程度最好，抑制率达33.45%；苍术药液浓度125 mg/mL时，作用16 h后抑孢子化程度最好，抑制率达13.88%；川楝子抑卵囊孢子率最弱，125 mg/mL作用16 h后抑制率仅达13.27%。

表2 8种中药材提取物处理不同时间兔球虫卵的抑卵囊孢子率 Table 2 Inhibitory rate of 8 Chinese medicine extracts treated rabbit coccidian oocysts with different time

3 讨论

我国中药材资源丰富，为筛选抗球虫药物提供了物质基础。土荆皮是具有杀虫、治癣疥等功效的常用中药材，内含土荆皮二萜酸、多酚(酸)类物质等多种化合物。桉叶主要含有桉叶油、黄酮类、有机酸类、酚类等具有较高生理活性的能抑制寄生虫的有效成分。研究发现，土荆皮和桉叶均有很好的抑制兔球虫卵囊孢子化的效果，可能与二者的主要化学成分有关。枯矾主要用于收湿敛疮、止血化腐，对大肠杆菌、痢疾杆菌等致病菌也有明显的抑菌作用。研究发现，枯矾的抑/杀球虫孢子化的效果也较好。

周钰奇等[16]用穿心莲片饲喂感染柔嫩艾美耳球虫的鸡发现，200 mg组中感染鸡的血便排出推迟1 d，且明显降低血便记分和粪便卵囊排出量，同时给予穿心莲片剂能部分缓解球虫感染对中枢免疫器官发育的抑制作用。李宗波等[17]用川楝子治疗鸡球虫病效果明显，且能够促进鸡免疫器官的发育和增强机体的免疫力。研究发现，穿心莲对兔球虫卵有一定的效果，而川楝子效果最差，后期可考虑在兔体内用药做进一步研究。马明智[18]用含有蛇床子、苍术等中草药煎剂饲饮患球虫病獭兔，总有效率达90%。祝学珍[13]研究发现，蛇床子、苍术有一定的抑制鸡球虫卵囊孢子化的效果，苍术优于蛇床子，但研究中蛇床子抑杀效果好于苍术，苍术的效果不明显，可能与球虫的种类不同有关，同时也提示蛇床子和苍术不管在体内还是体外对兔球虫卵囊孢子化均有抑杀效果。王玺德等[19]研究发现，石榴皮水提物有较好的体外抑制兔球虫卵囊孢子化的效果；但刘阳等[10]用石榴皮水提物直接对人工感染球虫病的兔新鲜粪便进行孢子化抑制效果检验发现其抑制效果弱。研究发现，石榴皮对兔球虫卵囊孢子化也有一定的抑制效果，但效果不佳，可能和药液的用药剂量有关。因此在寻找药物时，不仅要关注药物的品种，还要对药物的不同质量浓度进行研究。多数中草药以高浓度抑球虫卵囊效果优于低浓度。综上，土荆皮、桉叶等中药材对兔球虫卵囊孢子化具有显著抑制效果，川楝子对抑制兔球虫卵囊孢子化效果不理想，下一步可以考虑将单味中药材制成复合制剂。研究还发现，穿心莲、川楝子、蛇床子、苍术等药物的体外抑杀球虫效果与体内用药的报道不太一致，可能因为球虫在体内外的发育阶段和环境不同所致。研究中大部分中草药对球虫卵囊孢子化的抑制是随着浓度的增大而加强，与田美杰等[7]的研究结果一致。说明浓度是影响土荆皮等中药材体外抗球虫卵效果的重要因素。试验所选用的中草药均具有驱虫杀虫、祛湿、清热解毒、止血等功用，但试验结果表明，部分药物对球虫的抑/杀效果明显，仍有一些药物效果不太理想。因此，要筛选出有效的抗球虫药物，除考虑中草药本身功用，或与其他药物联用外，还需进一步对中药材作用的浓度和作用对象进行研究。研究表明，所选用的8味中药材水提物对兔球虫卵囊孢子化均具有不同程度的抑制作用，大部分中药材浓度越高，抑制效果越好，与作用时间有一定的相关性。抑制兔球虫卵囊孢子化的效果与药材种类有关，蛇床子的抑杀效果与时间和浓度共同作用有关，土荆皮、桉叶、穿心莲及枯矾等7种的浓度是影响体外抗球虫卵效果的重要因素。

4 结论

根据卵囊孢子抑制率，125 mg/mL土荆皮作用16 h效果最好，其对兔球虫卵的抑卵囊孢子率为83.10%；125 mg/mL川楝子作用16 h的效果最差，其对兔球虫卵的抑卵囊孢子率为13.27%。