犬和猫肠道菌群研究进展

郑晓蔓，林 琳，唐陆平，刘玉清

(佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东佛山 528000)

犬和猫肠道内寄居着大量复杂的微生物群(包括细菌、真菌、病毒和原生动物等)，构成了肠道微生态系统。肠道微生物的功能包括防御非寄居肠道病原菌，有助于宿主肠道上皮和免疫系统的健康发育，通过其发酵和代谢活性为宿主提供营养。大量研究证实，犬和猫肠道疾病的发生与肠道微生物菌群改变有关[1-2]。因此，对犬和猫肠道微生物结构组成和肠道微生物如何影响宠物健康的研究是非常必要的。

过去，肠道微生物学及微生物对宿主健康的影响的知识大多通过传统的微生物培养技术获得。而机体内只有不到1%微生物能在实验室内被培养和研究[3]。由于缺乏合适的研究方法，严重阻碍了肠道微生物研究进展。

细菌基因包含有高度保守的核苷酸碱基序列，根据细菌这一特点，通过细菌16S rRNA 基因的分子生物学方法能对肠道复杂微生物及其基因进行鉴定和特性描述。近年来随着高通量DNA测序技术、代谢组学技术及宏基因组学等新的分子生物学技术结合新的生物信息学的发展，为犬和猫肠道微生物的研究提供了极大的便利。论文从犬和猫肠道微生物的分布组成特点、犬和猫肠道共生微生物形成的影响因素以及肠道菌群结构改变与犬和猫急慢性肠病的关系方面综述了近年来国内外研究取得的进展。

1 健康犬和猫肠道微生物组成

1.1 犬和猫肠道微生物菌群的组成

1.1.1 犬肠道细菌群组成与分布 运用传统细菌培养技术，早期研究报道显示，健康犬小肠内细菌载量为102CFU/g～105CFU/g，另一些研究则发现犬小肠内细菌数量可高达109CFU/g。犬结肠内可培养细菌数量显著高于小肠，数量为108CFU/g～1011CFU/g[4]。

大多数犬肠道微生物研究采用16S rRNA基因测序方法检测分析粪便或结肠样本中微生物群组成和分布。研究发现，在肠道不同样本采集点(即十二指肠、回肠和粪便)，犬肠道微生物组成也存在差异。细菌从十二指肠转移到结肠过程中，细菌多样性和细菌总数呈普遍增加趋势。需氧菌和兼性厌氧菌是小肠内的优势菌群，而厌氧菌能在大肠内良好生长。 运用基于16S rRNA 基因扩增-Sanger测序法在6只健康猎犬结肠微生物菌研究发现了4种主要的微生物菌群，分别为厚壁菌门(Firmicutes，47.7%)、变形菌门(Proteobacteria，23.3%)、梭杆菌门(Fusobacteria，16.6%)和拟杆菌门 (Bacteroidetes，12.4%)。研究还发现，从十二指肠至结肠不同肠道区域内的微生物群组成分布存在差异，梭菌目(Clostridiales)是十二指肠和空肠内的优势微生物菌群，而梭杆菌目(Fusobacteriales)和拟杆菌目(Bacteroidales)是回肠和结肠内最丰富的微生物菌群。肠杆菌目(Enterobacteriales)菌类在小肠内出现频率明显高于结肠，乳杆菌类(Lactobacillales)在所有肠道内都有存在[4]。

运用基于16S rRNA基因测序技术对健康犬粪便微生物菌群检测发现，梭杆菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门是犬粪便中的共显性菌门[5]。高通量测序技术对健康犬盲肠微生物菌群研究结果显示，犬盲肠微生物菌群中优势菌门为厚壁菌门、拟杆菌门、梭杆菌门和变形菌门[5]。

Omatsu T等[6]基于16S rRNA基因条形码分析技术对21只健康贵宾犬的粪便微生物多样性进行了分析研究。结果发现，粪便微生物中厚壁菌门、变形菌门和梭杆菌门是优势菌门类群，占粪便微生物总量的93.4%以上。在科水平上，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、拟杆菌科(Bacteroidacea)和毛螺菌科( Lachnospiraceae)是优势微生物菌群。

1.1.2 猫肠道细菌群组成与分布 与人类和其他哺乳动物相比，虽然猫并不主要通过微生物发酵获得能量，但平衡而稳定的肠道微生物菌群依然对于维持猫的肠道健康是必不可少的。

大量研究表明，与其他哺乳动物相似，猫肠道内优势菌门包括厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和放线菌门[7]。然而有关文献报道的这些菌门类菌群比例在不同品种及个体间差异很大。

基于鸟枪法454-焦磷酸DNA测序技术的一项研究了评测了健康成年猫粪便微生物组成。结果显示，优势菌门包括厚壁菌门( 36%～50%)、 拟杆菌门(24%～36%)和变形菌门(11%～12%)。细菌是猫粪便中优势微生物，比例为99%，其次真核生物和真菌，分别为1%和0.05%[8]。

研究表明，犬和猫肠道微生物优势菌门与人类和啮齿动物模型相似，都是厚壁菌门和拟杆菌门。关键的不同之处是犬和猫肠道菌群(粪便或肠道)中的优势梭杆菌门，尽管此菌门类菌不是寄居于肠道内最大的菌属，但它常占10%或更多的序列。

1.2 犬和猫肠道其他微生物群的组成与分布

除细菌外，犬和猫肠道也是其他微生物包括真菌、病毒和寄生虫的寄居地，但这些微生物、寄生虫与宿主和细菌群相互间的复杂作用尚不明确。

1.2.1 犬和猫肠道真菌的组成与分布 有研究显示，犬和猫肠道内寄居着许多种真菌类微生物，在犬粪便中发现了多达40种不同真菌系统发育型 。

基于宏基因组测序结果表明，犬和猫粪便样本中真菌约占犬和猫粪便样本微生物的2%。

近年运用高通量测序技术，通过设计真菌通用引物对犬和猫肠道内微生物中的真菌组成进行检测结果发现，健康犬粪便中优势真菌类群是子囊菌门(Ascomycota，占测序总量的97.9%)和担子菌门(Basidiomycota，测序总量的1.0%)，并且子囊菌门也是在猫肠道内发现的唯一真菌类群[9]。

也有研究报道，在犬肠道内发现担子菌门(Basidiomycota)、球囊菌门(球囊菌门)和接合菌门(Zygomycota)真菌类群，纳沙酵母菌属(Nacaseomyces，76.72%) 或假丝酵母属(Candida，5.2%)是丰度最高的真菌属类群。而酵母菌属(Saccharomyces，58.31%)和曲霉菌属(Aspergillus，11%)是猫肠道内丰度最高的两类真菌属类群[10]。

还有研究发现，犬和猫肠黏膜样本中真菌DNA含量显著高于肠腔内样本，这提示某些肠道寄居的真菌可能具有黏膜黏附功能。

1.2.2 犬和猫肠道病毒的组成与分布 有关犬和猫肠道病毒组成部分的研究较少。运用鸟枪测序法对猫粪便中dsDNA病毒序列检测结果显示，仅有一个噬菌体目类病毒,即有尾噬菌体(Caudovirales)[11]。

研究发现，猫肠道内病毒约占肠道微生物序列的0.07%，大部分病毒属于有尾噬菌体目。总共有18个科和42个属[10]。

1.2.3 犬和猫肠道古细菌的组成与分布 研究发现，猫肠道内古生菌占肠道微生物序列的0.77%，由5个菌门[泉古菌门(Crenarchaeota)、广古菌门(Euryarchaeota)、初古菌门(Korarchaeota)、纳古菌门(Nanoarchaeota)和奇古菌门(Thaumarchaeota)]和12个纲组成[10]。

有关犬和猫肠道微生物组成的研究结果在不同研究报道间存在显著差异，这可能是由于试验方法(如样本采集及处理、DNA或RNA提取方式、DNA扩增操作步骤、引物设计及测序方法)的不同所致。

目前，虽然基于16S rRNA基因的高通量测序是描述肠道微生物群特性的最有效方法之一，但该法存在难以对总细菌群中低丰度类菌群进行检测的局限性。因此，检测犬和猫肠道内特异细菌类群时，应联合高通量测序和定量PCR等方法来评测这类低丰度菌群。

2 影响犬和猫肠道微生物群组成的因素

研究发现，许多因素(如年龄、遗传、日粮结构、个体差异、健康状态和生活环境等)都可能会影响健康犬和猫肠道微生物群的组成与分布[12]。

2.1 年龄对犬和猫肠道微生物群的影响

Alessandri G等[9]为研究年龄相关犬肠道核心菌群的变化，运用宏基因组学技术对4个年龄段犬(0～8月龄幼犬、9月龄～24月龄青年犬、25月龄～96月龄成年犬和大于97月龄老龄犬)粪便样本中微生物群进行了检测分析。结果发现，犬肠道核心菌属包括拟杆菌目(Bacteroidales)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、罗氏菌属(Roseburia)及梭杆菌属(Fusobacterium)菌群水平在4个年龄段犬存在显著差异。成年犬组粪便中梭杆菌属的相对丰度明显高于年轻犬组和老龄犬组，分别为28.80%、20.75%、17.58%；老龄犬组罗氏菌属相对丰度显著增加；与年轻犬组和成年犬组相比，幼犬粪便中拟杆菌目菌类含量更高。另外，与其他年龄段犬组比，年轻犬粪便中考拉杆菌属丰度更高。而且，与幼犬组比，成年犬组和老龄犬组犬粪便中双歧杆菌丰度明显减少。

Masuoka H等[13]采用细菌培养和分子生物学技术方法调查了5个不同年龄组(断奶前、断奶、年轻、成年和老龄)猫肠道微生物组成。结果发现，猫肠道微生物存在与年龄相关的变化，而这种变化特点与人类和犬不同。人类肠道优势菌双歧杆菌和犬肠道优势菌乳杆菌并不是猫肠道内的优势菌，而肠球菌可能是猫肠道内主要乳酸菌。

2.2 日粮结构对犬和猫肠道微生物群的影响

日粮结构也能影响犬的肠道微生物。长时间的禁食导致犬小肠微生物群发生显著变化，并且对微生物的代谢功能产生明显影响。饲喂含纤维日粮也对犬肠道微生物群组成产生影响[14-15]。

近年来，有许多关于运用高通量DNA测序技术研究饮食结构对犬和猫肠道微生物群的影响的报道。日粮添加蔗果三糖能促进犬粪便微生物内乳酸菌增长和增加粪便丁酸的浓度，饲喂低聚果糖日粮能增加犬粪便双歧杆菌的数量，对肠道健康起积极促进作用[16-17]。

Butowski C F等[18]运用Illumina MiSeq高通量测序技术研究了3种日粮结构[生肉、生肉加2%纤维(菊粉和纤维素)及商品猫粮]对健康猫肠道微生物群的影响。结果发现，日粮结构对猫肠道31类微生物群分布数量产生影响。普氏菌属(Prevotella)是饲喂商品猫粮的猫粪便中优势菌类，梭菌属(Clostridium)和梭杆菌属(Fusobacterium)是饲喂生肉猫的粪便中优势微生物群，而普氏菌属和消化链球菌(Peptostreptococcus)是饲喂生肉+纤维日粮猫粪便中的优势微生物群。这一结果进一步表明，不同的日粮结构能影响猫粪便微生物群的组成和代谢。

总之，这些研究表明，与人类相似，日粮摄取能调节犬和猫肠道微生物群的组成和活性。然而，需要更多研究关于日粮结构对犬和猫肠道微生物的影响及健康影响的研究仍需要做更多工作。

2.3 个体因素对犬和猫肠道微生物群的影响

研究表明，每个动物个体拥有独特的微生物组成谱。Handl S等[11]在属水平上检测健康犬和猫粪便微生物群可操作性分类单元(OTUs)，结果发现，12只犬的已确认85个OTUs仅有5个OTUs被检测到，12只猫的113个OTUs中仅有14个OTUs被检测到。这一结果提示肠道微生物组成在犬和猫不同个体间也同样存在明显差异。

2.4 遗传因素对犬和猫肠道微生物群的影响

Hand D 等[19]运用16S rDNA基因扩增-454-焦磷酸测序技术首次研究了许多有亲缘关系(如品种、遗传)的犬粪便微生物群分布组成特点。结果显示，尽管犬群中优势菌属存在变异性，但与无亲缘关系的犬相比，亲缘关系相近的犬的粪便微生物组成更相似。

2.5 其他因素对犬和猫肠道微生物群的影响

性别、品种等因素也可对犬和猫肠道微生物群组成和分布产生影响。

3 急慢性肠病犬和猫肠道微生物群的变化

与人类研究结果相似，犬和猫肠道疾病的发生也与肠道微生物群改变有关。不但涉及肠道内病原菌的入侵，而且肠道微生物参与了宿主肠道内许多重要的代谢过程(如胆汁酸代谢和发酵以及不易消化的碳水化合物和蛋白的利用)[20]。猫的慢性肠病以持续的肠道疾病症状为特征(如呕吐、腹泻等)。根据对不同应激源的反应，临床常将犬和猫慢性肠病分为食物反应性、抗生素反应性或类固醇反应性三类。

3.1 急慢性肠病犬肠道微生物群的变化

3.1.1 犬急慢性腹泻与肠道微生物群的变化 肠道环境的短期改变(如急性腹泻)能影响肠道微生物的组成。研究表明，健康犬的粪便微生物菌群明显不同于腹泻犬。急性腹泻患犬肠道微生物多样性减少，拟杆菌门和粪杆菌属菌群数量减少，梭菌属菌群数量增加 。同时与健康犬相比，腹泻犬粪便中丙酸浓度减少，并且转座酶功能基因和甲基受体趋化蛋白水平降低[21]。

腹泻犬粪便产气荚膜梭菌、屎肠球菌和粪肠球菌微生物群数量增加。运用荧光原位杂交技术对慢性腹泻患犬粪便优势微生物菌群的检测结果表明，与健康犬相比，腹泻犬粪便拟杆菌属菌群丰度显著增加，而乳杆菌-肠球菌微生物群数量明显减少[20]。

Minamoto Y等[22]基于Illumina高通量测序技术和实时定量PCR技术检测了健康犬和慢性肠病犬的粪便微生物群的变化。结果发现，慢性肠病犬存在明显的菌群失调，肠道细菌多样性和丰度菌减少，菌群失调指数明显高于健康犬。

3.1.2 犬炎症性肠病(IBD)与肠道微生物群的变化 炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)属于慢性肠病的一种，主要显示肠道内炎症，不明原因的肠道症状，对各种治疗药物不敏感。IBD病理发生过程尚不明确，但肠道菌群失调、肠道内炎性免疫反应和遗传倾向等因素可能与IBD的发生有关。

大量研究表明，IBD犬小肠和粪便微生物菌群发生明显改变[23]。Cassmann E等[24]借助内窥镜组织活检技术采集慢性肠病和健康犬回肠和结肠黏膜组织，运用荧光原位杂交技术调查了犬慢性肠病时回肠和结肠黏膜微生物群的组成和黏膜组织结构变化。结果发现，与健康犬相比，慢性肠病犬包含有更多的黏膜微生物群，主要由球形梭菌、直肠真杆菌、拟杆菌属、肠杆菌科及大肠埃希氏菌。黏膜与结肠黏膜细菌总量增加与犬IBD临床症状表现的严重程度有关(P<0.05)。结果提示，犬慢性肠病的病理发生与不同的回肠和结肠黏膜微生物群有关。

近年来，DNA测序技术已运用于肠病犬和猫肠道微生物变化的调查研究中。

Omori M 等[25]运用16S rRNA 基因高通量测序技术对IBD患犬、肠淋巴瘤患犬及健康犬肠道微生物进行了比较研究。结果发现，与健康犬相比，肠淋巴瘤患犬粪便优杆菌科类(Eubacteriaceae)菌群丰度显著增加；IBD患犬粪便中帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)和卟啉单胞菌属(Porphyromonas)菌群比例显著高于健康犬。这些结果提示，肠道微生物群失调与犬肠淋巴瘤及犬IBD相关。

Blake A B 等[26]研究发现，胰腺外分泌功能不全(exocrine pancreatic insufficiency，EPI)犬和慢性肠炎(chronic enteropathy，CE)犬粪乳酸含量显著增加，而粪便中次级胆汁酸的浓度显著减少。与健康犬相比，胰腺外分泌功能不全EPI犬存在明显的肠道微生物群失调，粪便大肠埃希氏菌、乳杆菌及双歧杆菌菌群的丰度增加，梭杆菌属和梭菌属(Clostridiumhiranonis)类菌群的丰度降低，菌群失调指数增高。这些代谢产物的变化提示微生物群失调患犬的肠道功能发生了改变，进一步证明了肠道微生物在犬和猫健康和肠道疾病发生中的重要作用。

而CE患犬同样也发生菌群失调，菌群失调指数明显高于健康犬。

近年来，有大量关于人类肠道疾病的宏基因组学和代谢组学研究报道，而有关犬和猫肠道疾病的宏基因组学和代谢组学研究报道较少。已发现，IBD病人的功能基因变化(包括氧化应激通路的改变和氨基酸生物合成减少)比系统发育的变化更一致。最近研究发现，慢性肠道疾病犬和猫也有相似的功能基因变化[27]。

3.2 急慢性肠病猫肠道微生物群的变化

Suchodolski J S等[28]通过16S rRNA基因测序对健康和腹泻猫粪便微生物进行了检测对比分析。结果发现，腹泻患猫粪便中伯克氏菌目(Burkholderiales)、肠杆菌科 (Enterobacteriaceae)及链球菌属和柯林斯氏菌属(Collinsella)的菌群数量显著增加；相反，健康猫粪便中弯曲杆菌目(Campylobacterales)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、巨单胞菌属(Megamonas)、螺杆菌属(Helicobacter)、罗氏菌属(Roseburia)菌群数量显著增加。慢性腹泻猫粪便中拟杆菌门类菌群丰度降低，急性腹泻猫粪便丹毒丝菌纲(Erysipelotrichi)和乳杆菌属类菌群丰度降低。结果提示，健康猫与腹泻猫粪便微生物组存在显著差异。

将来应对腹泻猫肠道微生物变化与粪便中微生物代谢产物浓度变化之间是否相关联进行更深入的研究。

研究犬和猫肠道微生物组成和代谢变化特点规律，对于发现新特异性急慢性肠道疾病生物标志物和新治疗药物的开发具有重要意义。

4 展望

总之，对犬和猫肠道微生物菌群的研究中取得了许多重要进展。已经证实了肠道菌群在犬和猫急慢性肠道疾病中所起的重要作用，并且最近研究提示肠道微生物群在犬和猫肠道外疾病的病理发生中也起关键作用。但目前的研究主要聚焦于肠道菌群及肠道微生物组学研究，而对肠道其他微生物如真菌、病毒的研究较少，而对肠道微生物的代谢组学研究较少，今后需要加强这一领域的研究。通过发酵反应，肠道微生物能产生多种代谢产物(如乳酸等)，需要更多研究来阐明这些细菌代谢物对犬和猫健康的影响。研究犬和猫肠道微生物组成和代谢变化特点规律，对于进一步完善和更好地理解肠道微生物与宿主相互之间的复杂作用机制，以及利用这些信息改善日粮、发现新特异性急慢性肠道疾病生物标志物和开展靶向性疾病治疗具有重要意义。